植物乳杆菌ZXH-1304S降解肌酐和尿酸的活力研究

张晓晖,关海滨,冬 颖,张爱武,*

(1.内蒙古医科大学附属医院药剂部,内蒙古呼和浩特 010059;2.内蒙古医科大学药学院,内蒙古呼和浩特 010110)

高尿酸血症是由于嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄障碍所导致的血中尿酸超标,尿酸盐晶体在关节、软骨等部位析出,严重者可导致痛风。目前我国约有高尿酸血症者1.2亿,发病率逐年升高且呈年轻化趋势,近年来,高尿酸血症的患病率呈逐年上升趋势,全球高尿酸血症的患病率高达5%～25%[1]。高尿酸血症由尿酸生成过多或尿酸代谢障碍引起,而尿酸生成过多仅占高尿酸血症病因的10%,尿酸代谢障碍占患病者病因的90%[2-3]。可见尿酸代谢障碍是高尿酸血症的主要病因,因此开发能够降解尿酸的药物成为治疗高尿酸血症的研究方向。

益生菌在维持肠道菌群的平衡、抵御外来微生物的侵害、调节肠道免疫系统方面具有重要的作用。目前益生菌已广泛应用于药品、保健品、食品等领域,治疗肠道菌群失调引起的急慢性腹泻、便秘等疗效显著[4-6]。而近年来随着对益生菌认识的深入,人们开始关注益生菌的其它功能,如降低血脂、血糖、提高免疫力、抗肿瘤、预防龋齿等功效,而降低血尿酸也是近年来发现的又一作用[7-8]。尿酸摄入过多是高尿酸血症的一大病因,尿酸氧化酶可将尿酸分解代谢,但人体不能产生尿酸氧化酶,因此尿酸主要从尿液和肠道排出[9]。目前用于治疗高尿酸血症的药物有别嘌醇、苯溴马隆、丙磺舒等,主要通过减少尿酸的合成及重吸收或促进尿酸排泄来发挥作用,但需长期使用药物,且药物副作用较大[10]。肌酐主要通过肠道内细菌产生的肌酐水解酶降解,当人体肠道肌酐浓度较高时可诱导大量细菌产生肌酐水解酶,如大肠杆菌、变形杆菌、肠球菌等均可产生肌酐水解酶,随着肠道内肌酐浓度的增高,这些细菌过度增生,从而导致肠道菌群紊乱,破坏微生态平衡[11]。近年来随着生物技术的发展,不少专家提出使用益生菌制剂分解肠道内的肌酐和尿酸,杨殿斌等[12]通过筛选发现植物乳杆菌DM9218能够降低大鼠血尿酸、尿素氮和肌酐的含量。刘芳[13]通过基因工程的手段将尿酸氧化酶和肌酐水解酶基因导入保加利亚乳杆菌中,使该菌获得了降解肌酐和尿酸的能力,可见通过定向筛选或基因工程的手段获得降解肌酐和尿酸的益生菌是可行的。

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是乳酸杆菌的一员,也是人体重要的益生菌。研究表明,植物乳杆菌对多种病原菌具有抗菌作用,并且其细胞壁中的肽聚糖能够调节机体免疫功能、改善机体免疫力,其发酵乳还能降低小鼠胆固醇[14-16],然而植物乳杆菌的降血清肌酐、尿酸的功能却未见报道。课题组前期通过实验筛选得到一株可降解肌酐和尿酸的植物乳杆菌ZXH-1304S,本实验研究了该菌株体外降解肌酐和尿酸的能力,并考察了该菌对大鼠血肌酐、尿酸的降解作用,为植物乳杆菌用于高尿酸血症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌ZXH-1304S 本实验室分离保存;MRS培养基、MRS诱导培养基(含1 mmol的肌酐和0.8 mmol尿酸) 北京陆桥技术股份有限公司;肌酐、尿酸、氧嗪酸钾、腺嘌呤、胃蛋白酶(1200～2400 U/mg)、胰蛋白酶(1000 U/mg) Sigma公司;NaCl、KH2PO3、HCl、NaOH、胆盐 国药集团化学试剂有限公司;Wistar雄性大鼠(7周龄,体重(200±10) g) 内蒙古医科大学附属医院。

SHAZ-200B恒温摇床 上海精密仪器仪表公司;Forma厌氧培养箱、Sorvall ST40低温离心机 美国Thermo;BX53显微镜 日本OLYMPUS;ADVIA2400全自动生化分析仪 德国SIEMENS。

1.2 实验方法

1.2.1 植物乳杆菌ZXH-1304S在MRS和MRS诱导培养基中的生长曲线实验 取保存的植物乳杆菌ZXH-1304S冻干菌种,接种于MRS液体培养基,38 ℃厌氧培养12 h,5%接种量(v/v)接种活化,连续活化四代。10%接种量(v/v)分别接种于MRS和MRS诱导培养基中静置培养12 h,对数生长期间隔1 h制作生长曲线。发酵液镜检观察显微形态。

1.2.2 植物乳杆菌ZXH-1304S体外降解肌酐、尿酸实验 培养12 h的发酵液8000 r/min离心20 min收集菌体,PBS重悬洗涤菌体,重复3次。在含1 mmol/L肌酐和0.8 mmol/L尿酸的人工肠液中加入终浓度为1×108CFU/mL的诱导植物乳杆菌ZXH-1304S,以不加菌体为空白对照,以未诱导的菌体为对比,37 ℃、100 r/min摇床反应2 h,8000 r/min离心20 min,取上清液。全自动生化分析仪检测肌酐和尿酸的含量。

1.2.3 诱导菌株耐酸和耐胆盐实验 人工胃液的配制,NaCl 0.2%、胃蛋白酶0.32%,用0.2 mol/L HCl调节pH为1.5后,0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌;人工肠液的配制,KH2PO30.68%、胰蛋白酶1%,用0.2 mol/L NaOH调节pH为6.8后,0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。取诱导活化的植物乳杆菌ZXH-1304S发酵液,按10%的接种量分别接种于pH1.5的人工胃液和含0.2%胆盐的人工肠液中,在0、2、4、6、8 h取样测定发酵液活菌数,并计算相对存活率。

相对存活率(%)=某时间点的发酵液活菌数×100/0 h时的发酵液活菌数

1.2.4 诱导菌株降解肌酐、尿酸动物实验 因雌性大鼠血尿酸值个体差异较大,因此本实验选用雄性大鼠为实验对象。实验分组:对照组(n=8)、模型组(n=8)、嗜植物杆菌低剂量治疗组(n=8)、嗜植物杆菌高剂量治疗组(n=8)、别嘌醇治疗组(n=8)。Wistar雄性大鼠40只适应性喂养2周,模型组每天给予300 mg/kg的氧嗪酸钾和100 mg/kg腺嘌呤灌胃,对照组给予同等体积的生理盐水灌胃,连续7 d。发酵液离心收集菌体,生理盐水重悬菌体得到菌悬液,治疗组在造模后每日给予植物乳杆菌菌悬液灌胃1 mL,低剂量组菌液浓度为1×107CFU/mL,高剂量组菌液浓度为1×109CFU/mL,对照组和模型组给予同等体积的生理盐水灌胃,连续7 d。别嘌醇治疗组给予每只大鼠60 mg/kg的别嘌醇灌胃,连续7 d。大鼠尾静脉取血,全自动生化分析仪检测血中肌酐和尿酸的含量。

1.3 数据处理

每组实验设3个重复,实验数据用SPSS 17.0处理,数据采用平均值±标准误差表示,组间比较采用t检验,p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌ZXH-1304S在MRS和MRS诱导培养基中的生长情况

采用平板混菌计数法[17]检测发酵液活菌数,菌体生长曲线如图1。

图1 植物乳杆菌ZXH-1304S的生长曲线和显微形态(1000×,标尺:10 μm)

如图1A所示,植物乳杆菌ZXH-1304S在MRS和诱导MRS中可稳定生长,0～2 h是菌体的适应期,2～8 h是菌体的对数生长期,8～10 h是菌体的稳定生长期,10 h之后菌体进入衰退期。在对数生长期时,菌体在MRS中的生长速率较诱导MRS中略快。在诱导MRS中菌体生长状况良好,说明该菌适应含肌酐和尿酸的生长环境。图1B为处于MRS培养基的处于对数生长期培养8 h的显微形态,图1C为处于诱导MRS培养基的处于对数生长期培养8 h的显微形态,两者无明显差别,均呈短杆状,生长状况良好。

2.2 植物乳杆菌ZXH-1304S体外降解肌酐、尿酸能力

如图2所示,未诱导的菌株对肌酐和尿酸几乎没有降解能力,而经过诱导的菌株表现出极显著降解肌酐和尿酸的能力(p<0.01),肌酐浓度下降46.87%,尿酸浓度下降30.75%,说明该菌体在诱导条件下可降解环境中的肌酐和尿酸。

图2 植物乳杆菌ZXH-1304S体外降解肌酐、尿酸实验

2.3 诱导后的植物乳杆菌ZXH-1304S耐酸和耐胆盐实验结果

如图3所示,菌株在pH1.5的人工胃液有一定量的死亡,但总体对酸的耐受性较好,8 h菌体存活率为78.23%。植物乳杆菌ZXH-1304S在胆盐环境下也表现出较好的耐受性,8 h菌体的存活率达84.38%,说明该菌株较好地耐受了酸性环境和胆盐环境,能够适应人体胃肠道。

图3 植物乳杆菌ZXH-1304S耐酸和耐胆盐实验

2.4 诱导菌株降解肌酐、尿酸动物实验结果

诱导后的植物乳杆菌ZXH-1304S干预高肌酐和尿酸模型大鼠结果如图4。

图4 诱导后的植物乳杆菌ZXH-1304S干预(A)肌酐和(B)尿酸大鼠模型

如图4所示,模型大鼠的肌酐和尿酸含量明显高于对照组,差异极显著(p<0.01),说明造模成功,植物乳杆菌低剂量组肌酐浓度与模型组相比无显著性差异,而尿酸浓度显著低于模型组(p<0.05)。植物乳杆菌高剂量组肌酐浓度和尿酸浓度均极显著低于模型组(p<0.01),别嘌醇对照组肌酐浓度和尿酸浓度均极显著低于模型组(p<0.01)。以上结果表明,高剂量的植物乳杆菌ZXH-1304S能够明显降低模型大鼠血中肌酐和尿酸浓度,其作用效果较别嘌醇略差。

3 结论

采用前期筛选得到一株能够降解肌酐和尿酸的植物乳杆菌ZXH-1304S,发现该菌在MRS诱导培养基中生长状况良好,其微观形态没有发生改变,说明该菌适合大规模培养,且该菌表现出较强的耐酸和耐胆盐能力。通过诱导培养后,该菌能够在体外降解肌酐和尿酸,体内实验也验证了其降解肌酐和尿酸的能力显著,仅比别嘌醇略低,其作用机制还有待进一步研究。植物乳杆菌为药食同源的益生菌,安全性极高,因此该菌有望进一步开发成为具有药用价值的益生菌制剂。