方格星虫酶解液Maillard反应条件优化及理化特性变化

牛改改,游 刚,*,王 培,宋秋漫,苏海媚,莫维维,梁樱莲

(1.北部湾大学食品工程学院,广西钦州 535011;2.广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室,北部湾大学,广西钦州 535011)

方格星虫(Sipunculusnudus),俗称“沙虫”,又叫海人参,在我国沿海区域分布广泛,其中以广西北部湾海域分布量最为丰富[1-2]。方格星虫味道鲜美,风味独特,且具有较高的食用与药用价值[3-4],广受消费者喜爱。目前方格星虫加工产品主要为冻制品与干制品,而相关的一些罐头制品、调味料等加工品比较少见。美拉德(Maillard)反应又称“非酶棕色化反应”,是一种羰氨缩合的非酶褐变反应,广泛应用于食品的加工过程[5]。Maillard反应会产生许多香气化合物与呈色物质[6],从而赋予产品特殊的色泽与风味,已广泛应用于虾副产物[7]、鲍鱼蒸煮液[8]、贻贝煮汁[9]、牡蛎酶解液[10]、鱼蛋白[11]等水产品水解液风味的改善,而关于方格星虫酶解液Maillard反应工艺优化的研究未见报道。

本实验以方格星虫酶解液(Sipunculusnudusenzymatic hydrolysate,SEH)为原料进行Maillard反应,以褐变度和感官评分为评价指标,在单因素实验的基础上,通过正交试验优化Maillard反应工艺条件,得到方格星虫酶解液美拉德反应产物(Maillard reaction products ofsipunculusnudusenzymatic hydrolysate,MRPs-SEH);另对SEH与MRPs-SEH的色泽参数、游离氨基酸与总氨基酸含量、荧光强度进行对比分析,研究SEH Maillard反应前后理化特性的变化,为方格星虫调味料的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜方格星虫(体长(10±1.6) cm,体宽(1±0.3) cm,体质量(9±1.8) g) 采自钦州市茅尾海海域;胰蛋白酶(4000 U/g) 南宁东恒华道生物科技有限责任公司;D-半乳糖 食品级，浙江一诺生物科技有限公司;无水葡萄糖 食品级，天津市科密欧化学试剂有限公司;麦芽糖 食品级，上海润捷化学试剂有限公司;α-乳糖 食品级，西陇化工股份有限公司;蔗糖 食品级，天津市华东试剂厂;盐酸、三氯乙酸等 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

分光测色计CM-3600d 日本柯尼卡·美能达公司;L-8900 氨基酸分析仪 日本Hitachi公司;RF-5301PC荧光分光光度计 日本岛津公司;DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂;DB-4不锈钢电热板 常州国华电器有限公司;840-210800紫外-可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司;H1850台式离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;ST5000 pH计 奥豪斯仪器(常州)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SEH的制备 参考文献[10],并稍作修改。将新鲜方格星虫去除内脏,清洗后沥干,以1∶5 (w/v)的比例加水后,用组织捣碎机在10000 r/min下进行破碎打浆10 min,按底物质量加入8%(w/w)的胰蛋白酶,调整pH7.5,53 ℃酶解2 h后于90 ℃灭酶10 min,酶解产物9000 r/min离心20 min,所得上清液即为SEH。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 糖种类的选泽 取一定体积的SEH,分别添加3%(w/v)的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖和蔗糖,搅拌使其溶解,调节体系的pH为8.0,于120 ℃热反应60 min后冷却,8000 r/min离心10 min,取上清液进行褐变度测定与感官评定,每组实验重复三次,结果取平均值。

1.2.2.2 糖添加量的影响 取一定体积的SEH,分别添加1%、2%、3%、4%和5%(w/v)的半乳糖,搅拌使其溶解,调节体系的pH为8.0,于120 ℃热反应60 min后冷却,8000 r/min离心10 min,取上清液进行褐变度测定与感官评定,每组实验重复三次,结果取平均值。

1.2.2.3 pH的影响 取一定体积的SEH,添加3%(w/v)的半乳糖,搅拌使其溶解,分别调节体系的pH为6.0、7.0、8.0、9.0和10.0,于120 ℃热反应60 min后冷却,8000 r/min离心10 min,取上清液进行褐变度测定与感官评定,每组实验重复三次,结果取平均值。

1.2.2.4 反应温度的影响 取一定体积的SEH,添加3%(w/v)的半乳糖,搅拌使其溶解,调节体系的pH为8.0,分别于100、110、120、130和140 ℃下热反应60 min。冷却后,8000 r/min离心10 min,取上清液进行褐变度测定与感官评定,每组实验重复三次,结果取平均值。

1.2.2.5 反应时间的影响 取一定体积的SEH,添加3%(w/v)的半乳糖,搅拌使其溶解,调节体系的pH为8.0,于120 ℃温度下分别反应30、45、60、75、90 min。冷却后,8000 r/min离心10 min,取上清液进行褐变度测定与感官评定,每组实验重复三次,结果取平均值。

1.2.3 正交试验 在单因素实验基础上,以感官评分为评价指标,以糖添加量、pH、反应温度和反应时间四个因素进行四因素三水平L9(34)的正交优化试验,各因素水平设计如表1所示。

表1 正交试验的因素水平表

1.2.4 感官评定 通过感官评定对MRPs-SEH进行风味评价。请经过培训且具有感官评定经验的10名(5男5女)食品专业本科生组成感官评价小组,进行感官评定。参照文献[9-10]制定感官评价标准,见表2。

表2 感官评价标准

1.2.5 褐变度的测定 将MRPs-SEH稀释10倍,在420 nm处测定吸光值,以其表示Maillard反应的褐变程度[12]。

1.2.6 反应前后色泽的测定 参考Huang等[13]的方法。分光测色计开机预热30 min后,分别用标准黑板和标准白板进行校准,取5 mL样品溶液于玻璃皿中,测定SEH与MRPs-SEH(最佳Maillard反应条件下制备)颜色参数L*(亮度)、a*(红绿值)、b*(黄蓝值)、C*(色度)和ΔE*(总色差)的变化,其中C*=(a*2+b*2)1/2,ΔE*=(ΔL*2+Δa*2+Δb*2)1/2;采用去离子水作为参比对照。

1.2.7 反应前后总氨基酸和游离氨基酸含量的测定 总氨基酸(Total amino acid,TAA)含量的测定参考Liu等[14-15]的方法,并稍作修改。分别取1 mL SEH与MRPs-SEH(最佳Maillard反应条件下制备)于水解管中,加入8 mL HCl(6 mol/L)于110 ℃水解22 h后冷却至室温。将消解液定容至50 mL后,取1 mL于50 mL烧杯中,60 ℃水浴赶酸完全后定容至10 mL,过0.22 μm膜后采用自动氨基酸分析仪测定。Maillard反应前后TAA含量的变化率X1计算方法如下:X1=(MRPs-SEH中TAA含量-SEH中TAA含量)/(SEH中TAA含量)。

游离氨基酸(Free amino acid,FAA)含量的测定参考Liu等[14-15]的方法,并稍作修改。分别取10 mL SEH与MRPs-SEH(最佳Maillard反应条件下制备)于100 mL烧杯中,加入10 mL 10%的三氯乙酸沉淀2 h,8000 r/min离心15 min后取2 mL上清液,过0.22 μm膜,采用自动氨基酸分析仪测定。Maillard反应前后FAA含量的变化率X2计算方法如下:X2=(MRPs-SEH中FAA含量-SEH中FAA含量)/(SEH中FAA含量)。

1.2.8 反应前后内源性荧光发射光谱扫描 参考Huang等[13]的方法。采用荧光分光光度计扫描SEH与MRPs-SEH(最佳Maillard反应条件下制备)内源性荧光强度的变化。扫描参数设定为:激发波长298 nm,发射光谱扫描范围309～450 nm,狭缝宽度5 nm,扫描温度25 ℃。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 糖种类的选择

糖的种类是影响Maillard反应强度的关键性因素[16]。由图1可知,蔗糖、麦芽糖和乳糖反应体系的褐变程度与感官评分均小于葡萄糖体系和半乳糖体系,说明双糖与SEH发生Maillard反应的活性较弱,产生的焦糖风味成分较少,这与Benjakul等[17]的研究结果Maillard反应速度己醛糖>二糖一致。半乳糖与SEH反应体系的褐变度和感官评分均显著大于葡萄糖反应体系(p<0.05),马振龙等[18]的研究结果显示猪骨蛋白水解物-半乳糖反应体系的褐变程度大于葡萄糖体系,与本研究结果一致;牛改改等[19]发现半乳糖-牡蛎蛋白肽Maillard反应产物的功能特性与抗氧化性均显著大于葡萄糖体系,说明半乳糖较葡萄糖具有更强的Maillard反应活性,支持了本研究结果。故后续实验选用半乳糖作为Maillard反应的糖基供体。

图1 糖种类对Maillard反应褐变度与感官评分的影响

2.2 糖添加量的影响

Maillard反应程度会随着还原糖添加量的增加而增加[20]。糖添加量对MRPs-SEH褐变度与感官评分的影响如图2所示。随着半乳糖添加量的增加,MRPs-SEH的褐变度与感官评分不断增加,说明Maillard反应程度在持续加深,褐色物质不断生成。当糖添加量达到3%后,褐变程度趋于平缓,相对稳定,并在4%时达到最大。感官评分在糖添加量4%时达到最大值,随后呈下降趋势;这是由于增大半乳糖添加量加快了Maillard反应速度,丰富了挥发性物质种类,增强了MRPs-SEH的整体风味[21],但糖添加量过大时,会发生焦糖化反应,使反应体系色泽加深的同时产生焦苦味,感官评分下降[22]。因此,半乳糖的适宜添加量为4%。

图2 糖添加量对Maillard反应褐变度与感官评分的影响

2.3 pH的影响

图3 pH对Maillard反应褐变度与感官评分的影响

2.4 反应温度的影响

由图4可知,随着反应温度的升高,褐变程度逐渐加深,表明高温可促进Maillard反应。相关文献研究结果[15,25]表明，在一定反应时间内,温度越高,Maillard反应速度越快,每升高10 ℃,反应速度增加3～5倍。MRPs-SEH的感官评分随着温度的升高先增加后减小,在130 ℃时达到最大值,这是由于反应温度过高时,产物会发生碳化,产生较强烈的焦糊味,因此,适宜的反应温度为130 ℃。

图4 反应温度对Maillard反应褐变度与感官评分的影响

2.5 反应时间的影响

从图5可以看出,随着反应时间的延长,褐变度先快速上升后趋于平缓,这主要是因为在反应初期褐色物质生成相对较少,吸光值较低,随反应进行,褐色产物累积,Maillard反应逐渐趋向完全[26]。反应时间在30～60 min时,MRPs-SEH风味随着反应的充分进行而浓郁,当反应时间超过60 min时,焦糊味和硫味越来越浓,掩盖了方格星虫原有的鲜味,感官评分下降,这可能与过量生成的类黑精色素被环化产生一系列吡嗪、吡啶等含氮杂环化合物有关[27]。故反应时间选择60 min。

图5 反应时间对Maillard反应褐变度与感官评分的影响

2.6 正交试验

感官评价可直接反映Maillard反应对SEH风味的改善情况,而褐变度反映的是Maillard反应的程度,褐变度过大时,MRPs-SEH风味反而会变差,故正交试验以感官评价为指标,优化Maillard反应条件,结果见表3。从表3可知影响感官评分结果的因素主次顺序为D(反应时间)>C(反应温度)>B(pH)>A(糖添加量),最优组合是A2B2C2D2,即4%的半乳糖添加量、pH9.0、130 ℃的反应温度和60 min的反应时间。由于正交实验中没有A2B2C2D2组合,故在该条件下进行3次验证实验,感官评定结果为(13.77±0.47)分,高于正交实验的任一组,说明该组合为MRPs-SEH风味改善的最佳条件。

表3 正交试验设计与结果

2.7 反应前后色泽参数的变化

SEH与MRPs-SEH的颜色参数如表4所示,由表4可知,Maillard反应前后颜色差异显著(p<0.05)。MRPs-SEH较小的L*与较大的ΔE*说明Maillard反应使酶解液亮度变暗,颜色加深。a*、b*和C*增大,表明MRPs-SEH颜色更加偏红与偏黄,色泽更加饱满;这是因为Maillard反应的终产物褐色素类黑精使体系颜色加深。Jonathan等[28]的研究结果表明,Maillard反应产物L*减小,a*与b*增大,颜色加深,与本研究结果一致。

表4 Maillard反应前后颜色参数的变化

2.8 反应前后游离氨基酸和总氨基酸含量变化

在Maillard反应过程中,一方面,FAA或肽中的氨基与糖分子结构中的羰基共价连接形成糖蛋白,另一方面,大分子肽分解成氨基酸和小分子肽,说明在反应进程中FAA含量变化是一个动态过程[15,29],因此Maillard反应的程度需由TAA含量表示。Maillard反应前后TAA含量变化如表5所示。由表5可知,Maillard反应产物中TAA含量较SEH显著降低(p<0.05),其中SEH中TAA含量为703.987 mg/g,MRPs-SEH中TAA含量较SEH降低60.27%,这是由于Maillard反应消耗的氨基酸大于肽分解生成的氨基酸,且Strecker降解、热分解、以及糖和氨基酸或肽结合形成Maillard产物使得TAA含量降低,与Liu等[14]的研究结果一致。Tyr与Met含量较SEH分别减少73.84%、72.98%,说明这两种氨基酸参与Maillard反应的程度较大,而His(含量降低44.85%)参与Maillard反应的活性相对较低。

表5 Maillard反应前后总氨基酸含量变化

Maillard反应前后FAA含量变化结果见表6。由表6可知,MRPs-SEH中FAA组成与SEH相同,除色氨酸被酸处理破坏未检出外,均检测出17种常见的氨基酸。各氨基酸含量和TFAA含量均有不同程度减少,MRPs-SEH中TFAA含量为124.682 mg/g,较SEH降低51.12%。MRPs-SEH中的苦味氨基酸Val、Leu、Ile、Met、Phe、Ser、Arg、His与鲜味氨基酸Asp、Glu、Gly、Ala含量较SEH均降低,而TUAA/TFAA与TBAA/TFAA则大于SEH,其中TUAA/TFAA较SEH增加了8.26%,大于TBAA/TFAA的增加率(1.90%),表明Maillard反应减少了SEH中的苦味,同时使鲜味氨基酸在总游离氨基酸中的比例增加。

表6 Maillard反应前后游离氨基酸含量变化

2.9 反应前后内源性荧光强度变化

Maillard反应前后酶解肽结构的变化可由内源性荧光强度变化来评价[30]。图6显示了SEH和MRPs-SEH的内源性荧光光谱图。当激发波长在298 nm时,SEH的最大荧光强度峰位于368 nm。SEH与半乳糖发生Maillard反应后,产物的荧光强度明显降低,荧光吸收峰几乎消失,这与SEH和半乳糖发生Maillard反应形成了屏蔽效应有关[13,31]。Huang等[13]和Corzo-Martínez等[31]分别发现卵清蛋白和β-乳球蛋白与还原糖发生Maillard反应降低了产物的荧光强度,引起蛋白质围绕色氨酸残基构象的变化;Corzo-Martínez等[31]进一步比较了不同温度(40、50 ℃)下Maillard反应产物最大荧光发射波长变化,发现40 ℃条件下还原糖影响β-乳球蛋白侧链结构,仅引起β-乳球蛋白三级结构变化而没有破坏原有结构,在50 ℃条件下β-乳球蛋白结构受还原糖影响较大,但未能确定是几级结构变化。本研究结果发现Maillard反应降低了产物荧光强度,引起SEH中多肽的结构变化,但尚不能确定是几级结构发生变化,后续实验将进一步利用圆二色谱和荧光光谱法探讨其结构变化。

图6 Maillard反应前后内源性荧光光谱变化

3 结论

方格星虫酶解液Maillard反应的最佳工艺条件为:半乳糖添加量4%、pH9.0、反应温度130 ℃和反应时间60 min,在该条件下感官评定达到13.77分。与SEH相比,MRPs-SEH的L*减小,a*、b*、C*和ΔE*均增大,Maillard反应使得酶解液亮度变暗,色泽加深且更加饱满。MRPs-SEH中的17种氨基酸含量较SEH均显著降低(p<0.05),其中Tyr和Met参与Maillard反应的程度较大,分别减少73.84%、72.98%,而His(含量减少44.85%)参与Maillard反应活性相对较低;另外,MRPs-SEH中鲜味氨基酸在总游离氨基酸中的比例较SEH增加8.26%。Maillard反应引起SEH肽链结构变化。后续实验将进一步采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用定性定量分析SEH与MRPs-SEH的挥发性风味成分变化,分析并找出主要风味贡献成分,为研发新型方格星虫调味品提供理论参考。

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