马铃薯Y病毒两个黑龙江烟草分离物的全基因组序列分析

姜瀚林，程林发，姜鹏超，郭兆奎，刘永中，李向东*

1 山东农业大学植物保护学院，山东泰安岱宗大街61号 271018；

2 山东潍坊烟草有限公司安丘分公司，山东省安丘市拥翠街129号 262133；

3 黑龙江省烟草科学研究所，黑龙江哈尔滨哈药路17号 150076

马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）是马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的代表种，是危害烟草和马铃薯等茄科作物的主要病毒。PVY基因组为正义单链RNA，全长约9700核苷酸（nt），5'-端有一个基因组连接蛋白（viral protein genome- linked，VPg），3'-端有 poly（A）[1]。

PVY侵染烟草可引起叶片花叶以及沿叶脉坏死等症状，造成烟草减产甚至绝收[2]，严重危害烟草生产。明确PVY基因组对鉴定病毒株系，研究其致病机理和指导检测及防治有重大意义。吴元华等依据生物学方法将东北地区PVY分离物进行株系划分；万秀清等[3]通过多重PCR和系统进化分析将黑龙江烟区PVY分离物划分株系，但未对序列进行重组分析、选择压分析等研究。本文测定了2个黑龙江烟草PVY分离物的全基因组序列，并与GenBank中35个PVY分离物进行了一致率、重组、系统发育和选择压力等分析，发现两个分离物均为PVYN-Wi株系，可为黑龙江烟区PVY检测及抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2个烟草样品采自黑龙江省哈尔滨市和牡丹江市，分别命名为Harbin和MDJ。大肠杆菌DH5α由本实验室保存。植物总RNA提取试剂盒Transzol、DNA凝胶回收试剂盒等均购自北京全式金公司；Phusion超保真DNA聚合酶购自Thermo公司，M-MLV反转录酶、pMD18-T克隆载体、LA Taq DNA聚合酶和末端转移酶购自TaKaRa公司；Super ScriptTMⅣ反转录酶购自Invitrogen公司。其他生化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 引物合成

使 用 DNAMAN（version7）对 GenBank中 的PVY序列进行比对，选择保守片段进行引物设计，引物由北京华大基因公司合成，序列详见表1。

表1 PVY全基因组扩增引物Tab.1 Oligonucleotide primers used to amplify the complete genome of PVY

1.2.2 植物总RNA提取、RT-PCR扩增及5′RACE

使用Transzol试剂盒提取植物总RNA，以Oligo（DT）15为引物，以M-MLV反转录酶进行反转录，分三段扩增5′端以外PVY基因组序列。5′端基因组序列由5′RACE获得，依照Elizabeth等[4]的方法进行。

1.2.3 克隆及序列测定

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外灯下切取目的胶条（2686bp、3777bp和3054bp）。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收PCR产物并连接pMD18-T载体，转化Escherichia coliDH5α感受态细胞后，蓝白斑筛选挑取白色单菌落，经PCR验证阳性后选取3个克隆送北京华大基因公司测序。

式中,平均输出电压为30 V,负载电阻30 Ω,输出电流为1 A,平均输入电压为20 V,则PWM占空比D为0.33,若最小输入电压为15 V,变换效率取95%,则满载时输入电流为

1.2.4 核苷酸序列一致率分析

测得序列使用DNASTAR软件包的Seqman软件进行拼接，通过CLUSTAL X1.81软件与GenBank中PVY分离物（表2）序列进行比对，使用MegAlign软件分析2个分离物全基因组与参比序列在氨基酸和核苷酸水平的一致率。

1.2.5 重组分析

比对后的序列用RDP（version4.95）软件包进行重组分析。通过软件包中 RDP、GENECONV、BOOTSCAN、MAXCHI、CHIMAERA、SISCAN 和3Seq 共七种算法进行分析。当四种以上算法支持重组，且P＜1.0×10-6时，可认定该分离物存在重组。同时用Simplot（version3.51）验证重组并绘制重组分析示意图。

表2 本文分析用的37个PVY分离物序列号及来源Tab.2 Accession number,host and geographical origin of the 37 PVY isolates analyzed in the paper

续表2

1.2.6 系统发育分析

以马铃薯A病毒（PVA）芬兰分离物（Z21670）为外组，使用MEGA7中 CLUSTAL W模块比对表2中37个PVY分离物的全基因组序列，并采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树，重复1000次并去掉小于50%的分支。

1.2.7 选择压力分析

使用 MEGA7中 Nei-Gojobri method（Jukes-Cantor）算法，分别计算各蛋白的dN/dS值。若dN/dS＞1，说明存在正选择；若dN/dS＝1，说明存在中性选择；若dN/dS＜1，说明存在负选择。

1.2.8 遗传分化系数

按照寄主来源将参比序列分为烟草和马铃薯两组，使用DnaSP（version5.10）计算两组序列遗传分化系数（FST）。若FST＝0，则两种群基因型完全相似；FST＜0.33，则两种群基因交流密切；若FST＝1，则两种群完全隔离。

2 结果

2.1 基因组结构

分离物Harbin和MDJ基因组RNA全长均为9699 nt（GenBank登录号分别为MH933741和MH933742）。Harbin基因组A、C、G、U的含量为 别 为 31.1%、18.9%、23.4% 和 26.6%，MDJ为31.0%、18.8%、23.5%和26.7%。

2个分离物基因组均包含2个开放阅读框（ORF）。ORF1起于186 nt，止于9368 nt，编码一个含有3061个氨基酸的多聚蛋白，该蛋白可被切割为P1、HCPro、P3、6K1、CI、6K2、VPG、NIa、NIb 和 CP 等10个蛋白。两个分离物蛋白酶P1的识别位点均为Q/G，HC-Pro的识别位点均为G/G，NIa的识别位点为Q/R、Q/S、Q/A、Q/G、E/A、Q/A、Q/A。ORF2起于2921 nt，止于3145 nt，由P3的氨基端滑动转录构成PIPO。

2.2 核苷酸和氨基酸一致率

在核苷酸水平上，Harbin、MDJ与分离物GBVC 26全基因组的一致率最高，三者之间均为98.5%，与美国分离物MN一致率最低，分别为85.0%和84.8%。在氨基酸水平上，Harbin和MDJ的一致率最高为99.5%。与美国分离物NC57一致率最低，分别为89.3%和89.2%。在 Harbin和MDJ 编码的11 个蛋白中，P1 变异最大，核苷酸一致率分别为71.5%～99.4%和71.7%～98.9%，氨基酸一致率分别为62.0%～99.6%和62.3%～99.6%。核苷酸水平上，CP变异最小，两分离物与其它分离物的一致率分别为89.7%～99.7%和88.5%～99.7%；氨基酸水平上，CI变异最小，两分离物与其它分离物的一致率分别为95.5%～100%和95.4%～100%（表3和表4）。

图1 PVY分离物Harbin和MDJ基因组结构示意图Fig.1 The genomic structure of PVY isolates Harbin and MDJ

表3 Harbin与其他PVY分离物核苷酸/氨基酸的序列一致率Tab.3 Sequence identities（%）between Harbin and other PVY isolates at nucleotide/amino acid levels

表4 MDJ与其他PVY分离物核苷酸/氨基酸的序列一致率Tab.4 Sequence identities（%）between MDJ and other PVY isolates at nucleotide/amino acid levels

2.3 重组结构

经RDP软件分析，7种软件都证明Harbin和MDJ均为重组分离物（表5）。两个分离物均为PVYN株系与PVYO株系分离物的重组体。Harbin分离物主要亲本为美国PVYO株系分离物Oz（1-502 nt；2396-9699 nt），次要亲本为瑞士PVYN株系分离物N-605（503- 2395 nt）。MDJ分离物主要亲本为美国PVYO株系分离物CW（1-508 nt；2518 -9699 nt），次要亲本同样为N-605（509-2517 nt）。Harbin分离物基因组有2个重组位点，分别位于P1基因内和HC-Pro基因的的3'-端，与PVYN-Wi株系重组类型一致；MDJ分离物基因组也有2个重组位点，分别位于P1基因内和P3基因的5'-端。

表5 分离物Harbin与MDJ重组分析Tab.5 Recombination analysis of isolates Harbin and MDJ

2.4 系统进化关系

系统进化分析结果显示，37个分离物分为9个组，分别对应9个PVY株系类型。其中Harbin和MDJ分离物均属PVYN-Wi组，同组的还有比利时分离物GBVC 26和波兰分离物LW。PVYE组的两个分离物PYVMON和PVYAGA全部来自巴西。PVYNTN-NW组由3个叙利亚分离物和一个德国分离物156var。PVYNTN组由Gr99等4个波兰分离物组成。PVYN组包含瑞士分离物N-605、中国分离物Guiyang、美国分离物Mont和英国分离物SCRI-N。PVYNA-N/NTN组则由中国分离物ME162、美国分离物RRA1、英国分离物SASA-6和加拿大分离物Tu660组成。PB209等3个美国分离物组成PVYN：O组。美国分离物MN和NC57，意大利分离物NNP，澳大利亚分离物KIP1，法国分离物Adgen和英国分离物CRM1组成PVYC组，加拿大分离物RB和O-139，美国分离物CO1898、Oz和CW以及英国分离物SCRI-O组成PVYO组。

图2 Harbin与MDJ分离物的重组模式示意图Fig.2 Recombination pattern of isolates Harbin and MDJ

图3 Harbin分离物重组分析示意图Fig.3 Recombination analysis of isolate Harbin

图4 MDJ分离物重组分析示意图Fig.4 Recombination analysis of isolate MDJ

2.5 选择压力

选择压力分析表明，PVY的11个蛋白的dN/dS值均小于1，说明11个蛋白均存在负选择。其中NIa的dN/dS值最小，为0.02776，而PIPO的dN/dS值最大，为0.38013，说明在PVY的11个蛋白中NIa受到的选择压最大，而PIPO最小。

图5 基于Harbin、MDJ和其他35个PVY分离物全基因组序列构建的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree constructedbased on complete genomic sequences of Harbin,MDJ and other 35 PVY isolates

表6 PVY各蛋白选择压力分析Tab.6 Selection pressure analysis of PVY proteins

2.6 遗传分化系数

将来自烟草和马铃薯的PVY分别作为一组，利用DnaSP分析遗传分化系数。结果表明，两组PVY间的FST值为0.04424，小于0.33，说明烟草PVY分离物和马铃薯PVY分离物间的基因交流非常频繁。

3 讨论和结论

3.1 我国烟田PVY分布及株系演化

1950年，陈瑞泰在山东临朐首次发现PVY为害烟草[5]。1978-1979年，陈瑞泰等调查黑龙江、山东、四川、辽宁和吉林5省烟区病毒病类型，主要病毒种类为TMV和CMV[6]，PVY并非主要病害。1983年，韩晓东[7]等报道PVY广泛分布与我国山东、河南、安徽、云南、广东、辽宁等10个烟区。1991年已扩大到13个省区，1996年则扩大至16个省区[6]。

吴元华等将东北地区烟草PVY分离物分为PVYO（普通株系）、PVYN（脉坏死株系）、PVYNS（茎坏死株系）和PVYC（点刻条斑株系）四个株系，黑龙江地区以PVYN（脉坏死株系）为优势株系。王劲波[8]等通过生物学方法鉴定山东烟区分为PVYN（坏死株系）和PVYC（普通株系）两个株系，PVYN（坏死株系）为优势株系。蔡伟［9］等经系统发育和重组分析鉴定山东、贵州、河南三省烟区PVYNTN-NW为优势株系。Tian等［10］证明中国烟草PVY可以分为PVYN、PVYO、PVYNTN、PVYN-Wi和 PVYN-HcO等 五个株系，其中3个黑龙江PVY分离物均属于PVYN-Wi株系。万秀清等［3］将黑龙江烟草PVY分离物划分为PVYNTN、PVYN、PVYN-Wi和PVYNTN-NW四个株系。本研究根据系统进化和重组分析结果证明采集的2个PVY分离物均属于PVYN-Wi株系。综合以上结果，PVYN-Wi株系是黑龙江烟草PVY的优势株系。

3.2 MDJ分离物重组位点分析

系统发育分析判定Harbin和MDJ均为PVYN-Wi株系，该株系为重组株系，两个重组位点通常位于P1和HC-Pro[11]。经重组分析，Harbin分离物重组位点与PVYN-Wi株系株系一致，MDJ分离物的第二个重组位点则位于P3，为新的重组位点。Hu等[12]曾对14个PVYN-Wi株系分离物进行重组分析，发现其中13个分离物的第二个重组位点均位于2395-2398nt处，仅分离物261-4（AM113988）第二个重组位点位于2417 nt处。本文参比序列有4个PVYN-Wi株系分离物，其中Harbin和LW两个分离物的第二个重组位点均在2395nt，位于HC-Pro 基因3'-末端，与PVYN-Wi株系的重组位置一致。分离物GBVC 26的第二个重组位点在2408nt，其重组位点位于P3基因[13]。MDJ分离物的第二个重组位点在2517 nt，比GBVC 26分离物又后移109 nt，两个分离物第二个重组位点均位于P3基因的5'-端。MDJ与Harbin两分离物序列一致率最高，且有相同的地理和寄主来源，但在系统进化树中，MDJ与Harbin分为两个分支（图5），拥有不同的重组类型（图2）。像MDJ分离物这种重组位点位于P1基因和P3基因内，重组区域包括部分P1基因、整个HC-Pro基因和部分P3基因的分离物可能是一类特殊的PVYN-Wi株系重组分离物。

3.3 烟草PVY毒源

生产上普遍认为PVY在马铃薯块茎上越冬，第二年随蚜虫取食马铃薯植株传播到烟草上[14]。本文将烟草PVY分离物与马铃薯PVY分离物分组并计算遗传分化系数，证明二者基因交流频繁，印证了此观点。杜绝烟草与马铃薯间作以避开初始毒源，并及时防蚜治蚜，切断传播途径，是防治烟草PVY行之有效的方法。本研究从PVY的遗传分化上为该方法提供了理论依据。

4 结论

本研究测定了黑龙江烟区2个PVY分离物的全基因组序列，进行了一致率、重组、系统进化和选择压分析，主要结论如下：

（1）Harbin和MDJ的基因组全长均为9699核苷酸，均为重组体，且MDJ分离物中存在新的重组位点。

（2）PVY根据全基因组序列分为9个组，其中Harbin和MDJ均属PVYN-Wi组。

（3）PVY的11个基因均处于负选择，其中NIa的选择压力最大。

（4）烟草PVY分离物和马铃薯PVY分离物基因交流频繁。