富钾烤烟品种成熟期根系分泌物和根际细菌多样性特征分析

张小全，阚洪赢，刘冰洋，魏星，胡育玮

河南农业大学烟草学院 郑州文化路95号 450002

根系分泌物在植物与周围微生物的相互作用中起重要作用。植物根系通过分泌各种次生代谢物质对根际微生物的种类、数量和分布产生影响,对根际微生物群落结构有选择塑造作用[1]。根际微生物群落结构变化也对植物根系分泌物释放、土壤物质循环、能量流动、信息传递有重要的影响,进而影响植物的生长发育过程[2-3]。

不同物种甚至是同一物种的不同基因型之间根系分泌物和根际微生物的种类和数量存在着差异[1,3]。在玉米[4-6]、小麦[7]、大麦[8]、牧草[9]等作物上也发现了根系分泌物和根际微生物在不同基因型间的变化。Chaparro等发现拟南芥根系分泌物的组分与含量随生长发育时期而显著变化,同时根际微生物群落结构也发生显著变化[10]。Gschwendtner等研究发现,不同马铃薯基因型之间根际微生物群落差异很大,而且在不同生长发育时期,马铃薯根际微生物群落结构也发生变化，这可能都与根系分泌物的组成和数量不同有关[11]。王戈等研究发现，不同黑胫病抗性烤烟品种不同发育时期的根系分泌物和根际微生物存在差异，这种差异与品种抗性密切相关[12]。对烤烟钾吸收利用效率不同的基因型旺长期根系分泌物和根际微生物数量研究发现，富钾品种ND202根系分泌物活化能力强，不同品种根际细菌数量差异大，烤烟的钾吸收利用与根系分泌物和根际微生物的差异有关[13-15]。烟草成熟期是决定烟叶钾含量的关键时期，打顶可导致由根系向地上部运输的钾离子减少，根系钾离子外溢量会显著增加[16,17]，而成熟期不同钾吸收利用效率烤烟品种根系分泌物和根际细菌多样性的差异却鲜有报道。

本研究选用不同钾吸收利用效率的烤烟品种为材料，比较了成熟期不同品种根际主要养分含量、根系分泌物和根际细菌多样性的差异，旨在为进一步研究烟草富钾品种成熟期高效吸收利用钾素的机理和富钾烤烟品种的筛选和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为富钾烤烟品种ND202、对照品种为K326、NC89。种子由河南农业大学烟草育种实验室提供。富钾烤烟品种ND202具有根系发达、活力强，根系分泌物活化能力强，钾吸收速高，叶片中的钾积累量大等特点[13-15]。

1.2 试验方法

试验在河南农业大学郑州科教园区进行。将种子消毒、浸种，催芽后播于装有蛭石、珍珠岩、草木灰和适量化肥的塑料格盘内育苗，至5 叶1 心时挑选生长健壮、整齐的烟苗进行移栽。

试验采用盆栽种植（每盆装25 kg土），供试土壤为土壤肥力一致的壤质潮土，理化性状为有机质11.50 g/kg，全氮0.85 g/kg，全磷0.11 g/kg，速效钾120 mg/kg，缓效钾675 g/kg，pH 7.67。烟苗5 月3日移栽，每个材料种植180株。施用肥料为NH4NO3、NaH2PO4和K2SO4，每盆纯氮、磷、钾元素的施用量分别为3.25g、3.25g、9.75g，分别在移栽时、移栽后第1周、移栽后第2周分3次施入，3次施肥量比例为2∶1∶1。移栽后，使用田间滴灌系统进行水分管理，保持土壤田间持水量在80%左右。烟株第一朵中心花开放50%时，进行打顶，每株留叶数22片，按优质烤烟生产技术进行田间管理。

成熟期根系分泌物的收集：在移栽后85 d（成熟期）各处理分别选3株生长一致代表性烟株，小心将烟株从盆中取出，防止伤及烟株根系。将根系用去离子水冲洗干净，在2000 mL去离子水中培养，每4 h通气30 min，24h后加入去离子水至2000 mL，连续培养2 d，收集剩余液体用去离子水定容至2000 mL，得到根系分泌物样品。

土壤样品的获得：在移栽前2d，随机取10盆，在表层土壤下20cm处，分别取100g土壤样品，充分混合后分三份，分别标记为CK 1～3（移栽前：重复I～III）。在移栽后85d（成熟期）每个品种各选6株，分别去掉2cm的表层土壤，轻轻抖动烟株根系外围土壤，即为非根际土；然后慢慢去除根系周围较大土块，用毛刷轻轻从烟株根系表面刷下土壤，即为根际土。根际土和非根际土分别充分混合均匀后分为三份，分别标记为R1 1～3（NC89根际土：重复I～III）、R2 1～3（K326根际土：重复I～III）、R3 1～3（ND202根际土：重复I～3）、NR1 1～3（NC89非根际土：重复I～III）、NR2 1～3（K326非根际土：重复I～III）、NR3 1～3（ND202非根际土：重复I～III）。各土样用灭菌牛皮纸包好，冰袋保存至实验室，再从每份土壤样品中取100g左右，置于灭菌的液氮冻存管中，保存在-80℃冰箱，用于土壤微生物多样性的检测，剩余土样用于土壤主要养分含量测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 烤烟根系分泌物的组成与含量测定

参照于会泳的方法[18,19]，将收集的根系分泌物定量过滤，然后用50 mL乙酸乙酯萃取，取有机相，减压浓缩至0.5 mL（45℃），过0.45 μm滤膜。在浓缩后的样品中加入0.14mL硅烷化试剂（BSTFA+10%TMCS），加盖密封后在80℃水浴中衍生2h，待测。将硅烷化处理的样品用TRACE GC ULTRA-DSQII测定根系分泌物的成分。采用电子轰击源，轰击电压70eV，扫描范围M/Z 50-650 amu，扫描速度0.2 s扫全程，离子源温度230 ℃。毛细管柱：HP-5MS UI柱，进样口温度250 ℃，柱温50℃（2 min），以6℃/min程序升温至250 ℃（保持15 min）。载气为He，流量1 mL/min，进样量为1 uL。应用NIST98质谱数据库，分析质谱图，确定各组分物质名称,并用归一法，测定各组分的相对含量。

1.3.2 土壤主要养分含量测定

根际和非根际土壤碱解氮含量的测定采用碱解扩散法，有效磷含量的测定采用钼锑抗比色法，速效钾含量的测定采用NH40AC浸提-火焰光度法[20]。

1.3.3 土壤细菌多样性测定

土壤微生物总DNA提取采用MO BIO公司试剂盒“PowerSoil DNA Isolation Kit"进行，使用1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计来检测样品DNA的纯度和浓度。

采用带Barcode 的V3-V4区域细菌通用引物341（5' - CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）and 806R（5' - GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）扩 增 细 菌16S rRNA 特异片段。PCR产物电泳检测后使用磁珠纯化作为二轮PCR模板，进行二轮PCR扩增和纯化，最后进行Qubit 定量。根据PCR产物浓度进行等量混样，用Illumina公司的Miseq测序仪测序。

使用Trimmomatic软件对原始双端序列进行去杂。再利用FLASH软件进行拼接。同时，利用usearch检测并去除序列中的嵌合体序列。测序数据进行预处理生成优质序列之后，采用UPARSE软件，按照序列相似度大于或等于97%，将序列归1个OTU（Operational taxonomic units）。使用QIIME 软件包挑选出各个OTU 的代表序列并统计每个OTU 中的丰度信息。所有代表序列采用RDP Classifier分别从门和属水平上进行物种注释（分类阈值>0.8）[21]。

2 结果与分析

2.1 不同烤烟品种成熟期根系分泌物含量比较

检测到的3个烤烟品种成熟期根系分泌物主要由酸类、酯类、酚类和醇类等组成（表1）。品种间根系分泌物的主要成分含量有差异，NC89根系分泌物的主要成分是尼古丁、2-甲基丙酸、棕榈酸、硬脂酸、邻羟基苯乙酸、邻苯二酚等，ND202根系分泌物的主要成分是棕榈酸、硬脂酸、尼古丁、棕榈油酸、邻羟基苯乙酸等，K326根系分泌物的主要成分是棕榈酸、硬脂酸、4-羟基苯乙醇、棕榈油酸、尼古丁、邻羟基苯乙酸等。ND202根系分泌有机酸含量占其已检测出根系分泌物总量的81.80%，比NC89高12.86%，比K326高15.98%。

表1 不同烤烟品种成熟期根系分泌物的组成与相对含量Table 1 Composition and relative content of root exudates of different flue-cured tobacco varieties at mature stage %

2.2 不同烤烟品种成熟期根际主要养分含量比较

成熟期不同烤烟品种根际和非根际土壤主要养分含量见表2。在相同施肥和栽培条件下，成熟期NC89和ND202根际土中的碱解氮和有效磷含量极显著的低于K326，速效钾含量3个品种间差异极显著，ND202根际速效钾土含量最低。成熟期ND202非根际土中的碱解氮极显著的高于K326和NC89，有效磷和速效钾含量3个品种间差异极显著且均为ND202最高。

表2 成熟期不同烤烟品种根际和非根际土壤主要养分含量比较Table 2 Comparison of main nutrients content between rhizosphere and non-rhizosphere soil for different flue-cured tobacco varieties at mature stage mg/kg

2.3 不同烤烟品种成熟期根际土壤细菌多样性比较

将来自移栽前土壤、三个品种的根际和非根际土壤的21个样品细菌测序结果的原始序列过滤掉低质量的序列后，拼接得到有效序列总数为683 813条，占原始序列数量的99.5%，各样品的有效序列数在10908条到 56144条之间。根据序列相似度大于或等于97%的原则，共获得108 451个细菌OTUs，分别属于41个细菌门，其中优势菌门（相对丰度> 1%）有11个，分别是酸杆菌门（Acidobacteria，36.59%），变形菌门（Proteobacteria，12.21%)，放线菌门（Actinobacteria，15.79%），绿弯菌门（Chloroflexi，10.12%），厚壁菌门（Firmicutes，9.16%)，芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，4.18%），TM7（3.25%），硝化螺旋菌门（Nitrospirae，2.26%），拟杆菌门（Bacteroidetes，2.04%），蓝 藻（Cyanobacteria，1.22%）和 浮霉菌门（Planctomycetes，1.07%）。

3个烤烟品种成熟期根际和非根际土壤主要细菌在门水平上相对丰度的比较见图1。与移栽前土壤相比，成熟期根际土壤酸杆菌门、绿弯菌门、TM7、芽单胞菌门、蓝藻的相对丰度明显增加，变形菌门、厚壁菌门、硝化螺旋菌门的相对丰度明显减少。根际土壤与非根际土壤相比，放线菌门、TM7相对丰度明显较大，酸杆菌门、拟杆菌门明显减少。成熟期3个烤烟品种间比较发现，ND202根际土壤与非根际土壤厚壁菌门、放线菌门丰度相对较高，K326根际土壤TM7、芽单胞菌门相对丰度明显较大。说明成熟期不同烤烟品种根际土壤细菌在门水平上多样性发生了变化，各品种在生长过程中逐渐形成了各自相对独立的细菌群落。

图1不同烤烟品种成熟期根际土壤主要细菌在门水平上相对丰度的比较(%)Fig.1 Comparison of the relative abundances of the main bacteria in the rhizosphere soil of different flue-cured tobacco varieties at the phylum level

3个烤烟品种成熟期根际和非根际土壤主要细菌在属分类水平上，共鉴定出252种细菌，相对丰度>1%的优势属有18 个（图2）。移栽前土壤中芽孢杆菌属（Bacillus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas）、Kaistobacter属、Pontibacter属等四个属的细菌相对丰度明显高于成熟期烟株根际和非根际土壤。烟株根际土壤中的链霉菌属（Streptomyces）、伦茨氏菌属（Lentzea）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、气微菌属（Aeromicrobium）等四个属的细菌的相对丰度高于非根际土壤。

ND202根际土壤中硝化螺菌属（Nitrospira）、Kaistobacter属、Steroidobacter属等三个属的细菌相对丰度高于非根际土壤，K326根际土壤中紫色非硫细菌属（Rhodoplanes）和Iamia属的细菌相对丰度低于非根际土壤，NC89根际土壤中野村菌属（Nonomuraea）和Pontibacter属的相对丰度高于非根际土壤。在根际土壤中，芽孢杆菌属、硝化螺菌属（Nitrospira）、乳酸乳球属（Lactococcus）、Steroidobacter属、Flavisolibacter属和野村菌属的相对丰度表现为ND202K326>NC89；在非根际土壤中，硝化螺菌属、Steroidobacter属和溶杆菌属（Lysobacter）的相对丰度表现为ND202K326>NC89。

图2 不同烤烟品种成熟期根际土壤主要细菌在属水平上相对丰度的比较(%)Fig.2 Comparison of the relative abundances of the main bacteria in the rhizosphere soil of different flue-cured tobacco varieties at the genus level

3 讨论

根系分泌物是植物与土壤进行物质交换和信息传递的重要载体，可介导植物对土壤中营养的吸收利用，根系分泌物的种类和数量受植物种类、基因型、发育时期、土壤类型、生长环境等因素的影响[3]。本研究发现成熟期富钾品种ND202根系分泌物中有机酸含量较高，根际土壤速效钾含量较低而非根际速效钾含量较高。高欣欣等使用水培和砂培的方法对旺长初期烤烟的根系分泌物的分离鉴定发现，烤烟根系分泌物主要是有机酸类，且品种间有差异[19]。周冀衡等研究发现不同基因型烟草根系分泌物对矿物钾均具有活化能力，且不同基因型烟草根系分泌物对不同矿物钾活化能力具有差异[22]。大量研究表明，根系分泌物中含有的有机酸，可以活化土壤中的矿物钾，增加植物对钾的利用。外施有机酸能够在一定程度上提高根际土壤中有效钾和烟叶钾的含量[23,24]。研究发现ND202根系分泌物对矿物钾具有较强的活化能力，与其根系分泌物中有机酸含量较高有关[13]。成熟期ND202根际土壤钾素吸收较多除了与其根系分泌物对矿物钾具有较强的活化能力，提高根际钾素供应外，还跟成熟期ND202根系较发达，钾离子通道和转运体基因相对表达量较高等吸收能力较强有关[25]。

植物根系分泌物和根际微生物间可以相互作用和影响。本研究发现3个烤烟品种成熟期根际和非根际土壤主要细菌在门水平和属分类水平上相对丰度有较大差异，可能跟成熟期3个品种的根系分泌物差异有关。根系分泌物对某些微生物具有吸引作用，比如豆科植物对根瘤菌的诱导[3]。随着新一代测序技术的出现，研究宿主基因型对土壤微生物群落组成的影响成为可能。对不同田间环境中27个玉米自交系的根际细菌多样性差异研究发现，基因型效应值较小，但可显著影响根际细菌多样性，而且基因型对根际细菌多样性效应是可遗传的[5]。有研究发现水稻中基因型效应可解释水稻根际微生物组成变化的30%[26]。蔡秋华等以青枯病和黑胫病不同抗性烤烟品种为材料，用平板稀释计数法和Biolog技术研究不同抗性品种不同生育期根际微生物群落动态及功能多样性的差异，发现不同抗性品种间根际微生物的群落结构和功能多样性存在差异，且同一品种因栽培环境的不同，其根际微生物的群落结构和功能多样性也有所变化[27]。不同黑胫病抗性烤烟品种微生物数量及群落多样性受生长发育和品种抗性影响，且差异主要表现在烤烟现蕾以前[12]。运用高通量测序技术，本研究也发现成熟期ND202根际土壤与非根际土壤厚壁菌门、放线菌门丰度相对较高，ND202根际土壤中硝化螺菌属、Kaistobacter属、Steroidobacter属等三个属的细菌相对丰度高于非根际土壤。不同品种不同发育时期的根系分泌物含量、根际微生物与根际土壤有效钾含量间的变化规律，根际微生物种类变化与根系分泌物种类和含量变化对钾素的吸收利用的影响等问题，还有待于进一步深入的研究。

4 结论

选用富钾烤烟品种ND202和常规品种K326、NC89进行盆栽试验,对成熟期根际主要养分含量、根系分泌物和根际细菌多样性的差异分析发现，成熟期富钾品种ND202根际土速效钾含量低于K326和NC89，非根际土速效钾含量高于K326和NC89，根系分泌物有机酸含量较高。成熟期3个烤烟品种成熟期根际和非根际土壤主要细菌在门水平和属分类水平上相对丰度有较大差异，ND202根际土壤与非根际土壤中厚壁菌门、放线菌门丰度相对较高，ND202根际土壤中硝化螺菌属、Kaistobacter属、Steroidobacter属等三个属的细菌相对丰度高于非根际土壤。根际土壤中链霉菌属、气微菌属和Iamia属的相对丰度表现为ND202>K326>NC89，而芽孢杆菌属、硝化螺菌属、乳酸乳球属、Steroidobacter属、Flavisolibacter属和野村菌属的相对丰度则表现为ND202