黄连素调控GRP78表达对内皮细胞新生血管的抑制作用

唐利红 麻庆乐 卢德赵

动脉粥样硬化病变处新生血管具有渗透性高、脆性大等特点，易使脂质及各种炎细胞浸润斑块[1]。而新生血管仅由一层内皮细胞构成，易破裂并诱发斑块内出血，从而促进动脉粥样硬化病变的发展[2]。可见，内皮细胞新生血管致使斑块不稳定是动脉粥样硬化发生的关键环节，而抑制血管新生是防治动脉粥样硬化的策略之一[3-5]。内质网应激与动脉粥样硬化斑块的发生、发展有着密切关系。葡萄糖调节蛋白78（glucose regu－lated protein 78kD，GRP78）是内质网上重要的分子伴侣，是内质网应激的标志蛋白。现有研究发现，所有能激活内质网应激的环境或化学因素都能相应提高血管内皮生长因子（VEGF）mRNA及转录后水平，且GRP78 mRNA表达与VEGF mRNA表达一致，故推测GRP78表达与斑块新生血管密切相关[6]。黄连素是一种异喹啉类生物碱，可从黄连、黄柏、三棵针等植物提取，具有稳定斑块、改善动脉粥样硬化病变程度的作用[7-8]。本研究通过体外培养内皮细胞，观察GRP78在内皮细胞新生血管中的表达及黄连素的干预作用，探讨黄连素的抗动脉粥样硬化作用及其可能机制，为动脉粥样硬化的治疗提供新靶点，为黄连素的临床应用提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）细胞株：人脐静脉内皮细胞（HUVEC），由浙江中医药大学生命科学学院实验室保存。（2）药物与试剂：黄连素（AB271B，中国天津一方科技有限公司），FBS（1414876，以色列 Biological Industries公司），4-苯基丁酸（4-PBA，P21005，美国 Sigma公司），毒胡萝卜素（TG，T9033，美国Sigma公司），GRP78抗体（11587-1-AP，中国武汉三鹰公司），VEGF抗体（A20150906104，中国Cloud-Clone Crop公司），缺氧诱导因子1α（HIF-1α）抗体（B3301，美国 Immuno Way公司），β-actin抗体（00211510，中国康为世纪生物公司）。（3）主要仪器：酶标仪（Spectra Max 190，美国Molecular Devices公司），qRT-PCR仪（Step One Plus，美国 Applied Biosystems公司），半干转膜仪（Trans-Blot Turbo，美国 Bio-RAD 公司），显微镜（BX53，日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC培养与传代 HUVEC接种于含10%无菌FBS、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）高糖培养液中，置37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中进行培养，细胞为贴壁细胞，呈长梭状。每天观察细胞形态，当细胞密度达到90%时，进行细胞传代培养，实验使用对数生长期的HUVEC。

1.2.2 细胞增殖能力检测 采用噻唑蓝（MTT）法。取对数生长期HUVEC，0.25%胰酶消化，调整细胞密度为5×103/ml，每孔 100μl接种于 96孔板中，置细胞培养箱中培养过夜。用含 0、25、50、75、100、200μmol/L 黄连素的培养液培养24h，每组设6个复孔。在培养结束前4h，每孔加入 MTT（5mg/ml）溶液 20μl。培养结束后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μl溶解结晶物，用酶标仪于490nm波长处测定吸光度，计算细胞相对存活率。

1.2.3 细胞分组 将处于对数生长期的HUVEC分为6组：对照组（正常培养的HUVEC），GRP78抑制剂4-PBA组（4-PBA 5mmol/L作用 24h），GRP78激动剂TG组（TG 300nmol/L作用 24h），黄连素低、中、高剂量组（TG 300nmol/L 联合 50、75、100μmol/L 黄连素分别作用24h）。

1.2.4 细胞迁移能力检测 采用划痕法。取对数生长期HUVEC，0.25%胰酶消化，调整细胞密度为2.5×105/ml，每孔2ml接种于6孔板中，置细胞培养箱培养，待细胞铺满单层后弃原培养液。用200μl枪头在6孔板底部单层细胞平行划痕，PBS洗3次，按照实验设计分别加入不含血清的含药培养液，置细胞培养箱继续培养24h后拍照，利用Image J软件分析细胞间距离，即迁移距离。

1.2.5 细胞成血管能力检测 采用体外Matrigel Matrix胶法。将各组处理好的HUVEC胰酶消化后，用无血清培养液重悬，调整细胞密度为2×105/ml，按每孔100μl细胞悬液的量接种于Matrix胶包被的96孔板，置细胞培养箱中孵育6h，镜下观察并拍照，利用Image-Pro plus 6.0软件分析管腔数目。

1.2.6 VEGF、GRP78、HIF-1α mRNA表达的检测 采用qRT-PCR法。Trizol法提取各组HUVEC中总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的纯度及浓度。根据反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA第一链，采用qRTPCR进行扩增，引物序列见表1。扩增条件：95℃预变性 5min；95℃变性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 5s，共扩增 40 个循环。计算公式 Ratio=2-ΔΔCT，ΔCT1=对照目的基因CT值-对照内参基因CT值，ΔCT2=实验组目的基因 CT 值-实验组内参基因 CT 值，ΔΔCT=ΔCT2-ΔCT1。代入公式计算Ratio，即mRNA相对表达量。

表 1 VEGF、GRP78、HIF-1α 引物序列

1.2.7 VEGF、GRP78、HIF-1α 蛋白表达的检测 采用Western blot法。提取各组细胞总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）法测定蛋白浓度，取20μg蛋白上样，调整样品至相同浓度，与上样缓冲液混合，100℃煮沸变性5min。经5%浓缩胶和10%分离胶进行电泳分离后，半干转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2h，将膜转入含一抗（β-actin 1∶3 000稀释，VEGF、GRP78、HIF-1α 1∶1 000 稀释） 的 TBST中，4℃孵育过夜。室温下TBST洗膜4次，10min/次，将膜转入含二抗（辣根过氧化物酶标记的二抗1∶8 000稀释）的TBST中，室温孵育2h；室温下TBST洗膜4次，10min/次。增强化学发光（ECL）显色，化学发光成像仪曝光1～2min，扫描图像并分析灰度，以目的蛋白/βactin的比值为蛋白相对表达量。

1.2.8 细胞内GRP78的定位观察 采用免疫荧光法。将细胞接在玻片上，放入6孔板中，在CO2培养箱中培养至细胞密度适中（60%～75%）；取出玻片，在 PBS（pH7.0）中蘸洗10次，吸干多余液体，放入每孔装有2ml多聚甲醛的6孔板中，室温固定10～15min；取出固定好的玻片，在PBS中蘸洗10次，放在干净的载玻片上。在玻片上滴加相应抗体4°C过夜。次日玻片在PBS中蘸洗20次，放在载玻片上，滴加荧光二抗，常温避光放置1h。在PBS中蘸洗20次，封片。在荧光显微镜下观察GRP78定位及表达情况。

1.3 统计学处理 应用GraphPad Prism 5.0统计软件。计量资料用表示，两组比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度黄连素对细胞增殖能力的影响 与对照组（黄连素浓度为0）比较，黄连素浓度为25、50、75、100μmol/L组细胞相对存活率均略有下降，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）；黄连素浓度为200μmol/L组细胞相对存活率明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。因此，本实验黄连素的处理剂量选择50、75、100μmol/L。

图1 不同浓度黄连素对细胞增殖能力的影响（与0μmol/L组比较，*P＜0.05）

2.2 黄连素对细胞迁移能力的影响 与对照组比较，4-PBA组细胞迁移距离明显较短（P＜0.05）；TG组细胞迁移距离明显较长（P＜0.05），24h时已迁移至接近汇合。与TG组比较，黄连素低、中、高剂量组细胞迁移距离明显较短（均P＜0.05），说明黄连素能抑制TG诱导的细胞迁移，见图2。

图2 黄连素对细胞迁移能力的影响（a：对照组；b：4-PBA组；c：TG组；d：黄连素低剂量组；e：黄连素中剂量组；f：黄连素高剂量组；与对照组比较，*P＜0.05；与 TG 组比较，△P＜0.05；×400）

2.3 黄连素对细胞成血管能力的影响 与对照组比较，4-PBA组管腔数目明显减少（P＜0.05），4-PBA能抑制内皮细胞血管生成；TG组管腔数目明显增多（P＜0.05），TG可诱导内皮细胞血管生成。与TG组比较，黄连素低、中、高剂量组管腔数目均明显减少（均P＜0.05），说明黄连素能抑制TG诱导的内皮细胞血管生成，且呈一定的浓度依赖性，见图3。

2.4 黄连素对HUVEC中 VEGF、GRP78、HIF-1α mRNA表达的影响 与对照组比较，TG组HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1αmRNA相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与TG组比较，黄连素中、高剂量组 HUVEC 中 VEGF、GRP78、HIF-1α mRNA 相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图 4。

2.5 黄连素对HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α 蛋白表达的影响 与对照组比较，TG组HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α蛋白相对表达量均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与TG组比较，黄连素低、中、高剂量组HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α蛋白相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图 5。

图5 黄连素对HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α 蛋白表达的影响（a：对照组；b：4-PBA组；c：TG组；d：黄连素低剂量组；e：黄连素中剂量组；f：黄连素高剂量组；与对照组比较，*P＜0.05；与 TG 组比较，△P＜0.05）

2.6 黄连素对细胞膜上GRP78表达的影响 荧光显微镜下观察GRP78分布于内皮细胞的细胞膜上，TG刺激后细胞膜上GRP78高表达，而4-PBA（5mmol/L）及黄连素（50、75、100μmol/L）能明显降低细胞膜上 GRP78表达，见图 6（插页）。

图6 黄连素对细胞膜上GRP78表达的影响（a：对照组；b：4-PBA组；c：TG组；d：黄连素低剂量组；e：黄连素中剂量组；f：黄连素高剂量组；红色信号代表GRP78，蓝色信号代表细胞核，合成图片可观察GRP78在细胞膜上表达情况；×200）

3 讨论

斑块内病理性新生血管是动脉粥样硬化进展及不稳定斑块形成的关键之一，抗血管新生研究对于动脉粥样硬化进展及不稳定斑块形成的防治具有重要意义。国内外研究表明，抑制血管新生能够延缓动脉粥样硬化进程[9-12]。本研究应用黄连素作为抗血管新生药物，主要考虑到目前常规治疗动脉粥样硬化的他汀类药物费用昂贵，且存在肝损伤、肌肉溶解等不良反应。黄连素一直被传统中医用于治疗腹泻、痢疾、疟疾等胃肠道感染性疾病[13]；近年来，多项基础研究证实黄连素是一种机制完全不同于他汀类降脂作用的中药单体[14-16]，可有效治疗动脉粥样硬化，且安全性高、价格低廉。因此，深入研究黄连素抗动脉粥样硬化机制、拓展其临床应用具有积极意义。

动脉粥样硬化斑块内新生血管主要由外膜的滋养血管芽生而来，随着斑块内炎症反应增强和斑块体积增大，斑块内的新生血管数量逐渐增多，并逐渐向血管内皮下生长[17-18]。新生血管的结构不完善，管壁薄，内皮细胞间连接不紧密[19]。新生血管的高渗透性会导致血液中脂质、炎症细胞和红细胞从管腔中漏出，进入斑块内环境，加上血管易破裂使得斑块内出血的可能性增大，从而加重管腔狭窄[20]。本文通过体外血管生成实验证实黄连素具有抑制内皮细胞增殖、迁移及成血管能力。

为了揭示黄连素抗血管生成的作用机制，笔者探讨了GRP78与血管新生的关系。GRP78是内质网中极其丰富的分子伴侣蛋白，也被称作免疫球蛋白重链结合蛋白，是启动内质网应激时未折叠蛋白反应（UPR）级联合信号途径[21]。越来越多研究表明，内质网应激对动脉粥样硬化血管生成起着关键作用，在动脉粥样硬化性疾病中，内质网应激通过UPR系统中应激信号跨膜感受蛋白相关的机制上调VEGF表达，从而促进血管生成。在内质网应激时，GRP78可阻止未折叠蛋白合成及错误折叠蛋白聚集，促进其正确折叠，从而恢复内质网稳态[22]。那么，GRP78与血管新生的关系如何呢？Annat等[23]研究表明，内皮细胞受刺激后GRP78在细胞膜上的表达与血管新生有关。本实验采用GRP78激动剂TG及抑制剂4-PBA干预HUVEC，发现TG能有效促进其迁移及管状结构形成，而4-PBA处理后效果相反，这证实GRP78可诱导内皮细胞血管生成。VEGF是目前所发现的唯一特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，是一种具有促进血管新生和组织修复的血管生成因子[24]。由于动脉粥样硬化斑块形成时，内环境处于缺氧状态，有氧代谢细胞中HIF-1α会被激活且不断积累，并能稳定表达蛋白，通过诱导VEGF表达，特异性地结合位于新生血管内皮上的VEGF受体，促进内皮细胞生长，形成新的血管管腔，以维持斑块内的氧供需平衡[25]。笔者进一步对HUVEC中VEGF、HIF-1α表达进行检测，结果发现GRP78的表达与VEGF、HIF-1α的表达一致，说明GRP78诱导VEGF、HIF-1α表达的血管生成机制是一个独立的机制。采用黄连素干预TG刺激后的HUVEC，VEGF、HIF-1α、GRP78表达均明显下降，且细胞迁移、成血管能力均明显减弱，这说明黄连素可能通过调控VEGF、HIF-1α、GRP78表达的机制从而抑制内皮细胞血管新生。同时，免疫荧光法观察并证实了4-PBA及黄连素能明显降低细胞膜上GRP78表达。

综上所述，GRP78与内皮细胞新生血管有关。GRP78激动剂TG可增加VEGF、GRP78、HIF-1α的mRNA和蛋白表达，增强细胞迁移、成血管能力；经黄连素处理后，内皮细胞中 VEGF、GRP78、HIF-1α 的 mRNA 和蛋白表达量降低，细胞迁移、成血管能力减弱。黄连素可能通过抑制GRP78表达从而抑制内皮细胞血管新生。