动静脉特异性内膜增生信号通路的研究现状

付品婷，邬光敏，郭媛媛

（昆明医科大学附属心血管病医院/云南省阜外心血管病医院 血管外科，云南 昆明 650032）

动静脉特异性内膜增生引起的血管狭窄，往往是自体静脉移植、人工或组织工程血管植入、腔内支架置入术后血管再狭窄的主要原因，目前研究发现动静脉分子指纹EphrinB2/EphB4参与内膜增生过程的调控，本综述对EphrinB2/EphB4参与介导的相关信号通路作阐述，以期为临床干预提供方向。

1 动静脉分化和血管分子指纹

中胚层细胞分化形成的原始毛细血管网经过个体复杂的血管生成、分化，重构为动脉、静脉和淋巴管网[1]，动脉与静脉不仅仅存在结构与功能的区别，两者更具有基因水平上的差异，在促红细胞生成素肝细胞激酶受体（erythropoietinproducing hepatocyte kinase receptor，Eph）及其Ephrin配体家族中，EphB4、EphrinB2在胚胎发育期血管中的表达较的其他成员出现时间更早，EphB4在E9.0（小鼠）就表达于静脉内皮，而EphrinB2比EphB4稍早（E8.5），EphrinB2/EphB4不对称分布于动静脉内皮细胞 ，提示EphrinB2/EphB4参与原始血管动静脉分化[2-3]。在成年动物血管上，EphrinB2、EphB4分别分布于动脉、静脉内皮细胞及平滑肌细胞[4]，并分别维持着成年动物动静脉的结构及功能稳定，是动静脉的分子指纹。

1.1 EphrinB2/EphB4的表达调控

发育生物学研究结果提示：决定EphrinB2/EphB4恰当表达，进而决定动静脉分化的上游因素可能是Notch信号途径，血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）部分或主要参与了Notch途径的激活[5]。在动脉成血管细胞前体中，VEGF-A/VEGF-R2与neuropilin-1（NRP1）形成复合物激活Notch信号，但VEGF-A/VEGF-R2/NRP1复合物的形成机制尚不明确，SOXF转录因子又与RBPJ蛋白相互作用，活化Notch，VEGF通过ETS家族转录因子上调Notch的关键配体Delta-like 4（Dll4），通过Delta-Notch途径诱导动脉内皮细胞标志物EphrinB2的产生，促进动脉分化[6-7]（图1A）。Sturtzel等[8]在斑马鱼模型中研究发现，转录因子FOXF1上调VEGFR-2和EphrinB2，这进一步说明Notch2、VEGFR-2和EphrinB2是FOXF1功能的下游介质。 在静脉内皮细胞中，鸡卵清蛋白上游启动子转录因子II（chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor，COUP-TFII）通过抑制VEGF-A/VEGF-R2/NRP1复合物中的NRP1、Jagged-1和Notch信号分子的表达而诱导生成EphB4，但抑制EphrinB2的表达，Chen等[9]研究发现，抑制静脉内皮COUP-TFII表达后，静脉内皮上表达动脉标志物EphrinB2，静脉逐渐出现动脉表型。VEGF下调EphB4和上调DII4都是通过MEK/ERK信号调控的，并不通过PI3K/Akt信号调控，PI3K-Akt通路通过抑制ERK/MAPK通路，积极促进静脉分化[10]（图1B）。在内皮细胞（endothelial cells，ECs）特异性缺失SMAD4的小鼠和鱼类中，Neal等[11]证明SMAD4在获得静脉而非动脉特性时是必需的，另外在ECs中识别出一种包含必需SMAD结合基序和SMAD1/5结合的静脉内皮特异性增强因子，结果表明，静脉基因通过BMP/ALK3/SMAD1/5信号级联直接转录激活，再次支持了内皮祖细胞在发育早期就获得独立信号通路决定下游的动静脉分化。

1.2 VEGF-R2介导的信号通路

图1 EphrinB2/EphB4的表达调控与动静脉分化Figure 1 The expression of EphrinB2/EphB4 and arteriovenous differentiation

目前已知与血管内皮细胞功能有关的VEGF-R2下游传导通路主要为3条：⑴ PLCγ-ERK1/2-RAF1-MEK-ERK1/2。该途径在血管发育和成年动脉生成具有核心作用[12]，VEGFR2 Y1173磷酸化后结合并激活PLCγ，促进三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-trisphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）的生成，IP3从内质网释放钙,支持依赖Ca2+的DAG诱导激活蛋白激酶Cβ2（PKCβ2），然后调节RAF1-MEK-ERK1/2级联反应，这一途径绕过了RTK诱导RAS激活的RAF1-MEK-ERK1/2级联反应[13]。⑵ PI3K-AktmTOR通路，是内皮细胞存活、血管运动调节和屏障功能调节的关键通路[14]。⑶ SRC和小GTPases参与内皮细胞的形态、迁移和极化，以及内皮细胞间的连接和血管屏障功能的调节[15]。除此之外，VEGF-R2还激活了p38 MAPK、STATs和G蛋白偶联受体（GPCR）依赖性信号分子。Sturtzel等[8]在斑马鱼模型中研究发现，转录因子FOXF1上调VEGFR-2和EphrinB2，而下调静脉标志物EphB4的表达，这进一步说明Notch2、VEGFR-2和EphrinB2是FOXF1功能的下游介质。

2 动静脉内膜特异性增生与EphrinB2/EphB4的相互作用

ECs损伤是血管内膜增生的病理基础，ECs损伤后通过产生多种血管活性物质作用于血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs），促进VSMCs的表型转换而加剧内膜增生，EphB4/EphrinB2的相互作用与这一过程密切相关。EphB4的特异性配体EphrinB2与其他可溶性配体不同，两者均为跨膜蛋白，由糖基化细胞外域，跨膜区和胞内域组成，所以EphB4与EphrinB2之间相互作用调节血管生成，是通过细胞-细胞相互接触而完成的，两者可互为配体激活对方，目前大量研究认为以EphrinB2为配体激活EphB4为正向信号；反之以EphB4为配体激活EphrinB2为反向信号。

2.1 静脉分子指纹EphB4激活后的正向信号通路

以EphrinB2为配体刺激EphB4磷酸化而激活系列下游信号通路，可诱导EC的迁移和增殖，其中下游信号分子PI3K/Akt共同作用于迁移和增殖过程，但在Akt后产生差异[16]。

PI3K/Akt-eNOs/NO通路为EphB4介导的ECs迁移的经典途径，NO的下游信号通路可能是通过局灶性黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK）传导[17-18]。Steinle等[16]研究表明，PI3K/Akt-NFκB-MMP级联也可能参与EphB4介导的ECs迁移，在EphrinB2/Fc诱导MM1细胞迁移中，EphB4阳性内皮细胞的PI3K/Akt信号通路被激活，随之基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP-2）和MMP-9被激活并发挥作用，其机制为MMP-9在其启动子中有一个NF-κB结合位点，激活的Akt增加了NF-κB的转录激活，进而活化MMP-2和MMP-9[19-20]。

EphB4介导的内皮细胞的增殖主要通过PI3K/Akt-eNOs/NO-cGMP/PKG-Raf/MEK/MAPK通路进行调控[16,21-22]。研究显示，Akt能特异性地使内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthases，eNOS）磷酸化，增加亚硝酸盐的产生，从而激活cGMP-PKG信号通路[23-24]。在Steinle等[16]研究中，使用PI3K、Akt、PKG、MEK的阻断剂后，由EphrinB2-Fc诱导正向信号引起的内皮细胞增殖受到抑制。

研究[25]用EphrinB2-Fc处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），MEK/ERK通路受到抑制，p120RasGAP参与该通路的介导；但在乳腺癌细胞系MCF7细胞中，MCF7细胞在蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2A（protein serine/threonine phosphatase 2A，PP2A）参与下Ras/ERK通路被激活。Adams等[26]同样发现PP2A的亚单位AbαC与ABδC通过作用于Raf1下游及MEK1/2上游而正向调控Raf1-MEK1/2-ERK1/2通路，出现这样的差异可能是不同细胞之间对同一分子的不同反应。另外，当在EphrinB2-Fc刺激下，静脉分子指纹EphB4的持续表达也同样可能通过ERK1/2途径影响内皮细胞的迁移功能而影响移植静脉重塑[27-28]。Cao等[29]通过共同培养人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs）和HUVECs发现EphrinB2和Ephs介导的双向信号通路通过激活PI3K/AKT/mTOR通路，促进HUVECs血管生成，维持HBMSCs自分泌，促进骨缺损修复。而当EphrinB2或EphB4的敲低后会显著抑制内皮发芽，导致毛细血管芽减少，血管生成减少[30]。

2.2 动脉分子指纹EphrinB2激活后的反向信号通路

激活EphrinB2反向信号可促进血管内皮细胞的黏附、迁移、趋化、毛细血管网形成和血管新生，与EphB4激活的正向信号不同的是，由于缺乏内在催化活性，EphrinB2介导的反向信号依赖于募集信号分子[31]。EphrinB2胞内区有5个保守的酪氨酸残基和C端的PDZ结合域，其特有的结构提示EphrinB2可能通过酪氨酸磷酸化依赖和 PDZ 结合结构域介导2种方式向胞内传递信号[32-33]。

以EphB4为配体结合EphrinB2，快速募集Src家族激酶SFKs到EphrinB2附近，使EphrinB2酪氨酸残基磷酸化，然后与接头蛋白Grb4的SH2/SH3结构域以及转录激活因子STAT3相结合激活下游信号通路[34-35]，EphrinB-Grb4复合物可激活FAK催化活性，并招募G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白（GIT）1；Grb4还可通过SH3结构域结合原癌基因c-CbI相关蛋白（CAP）、Abi相互作用蛋白（Abi-1）、Axin蛋白、动力蛋白（dynamin）、核内不均一核糖核蛋白体K（hnRNPK）、及p21活性蛋白激酶（Pak1）等下游信号分子，介导ECs的迁移[36-37]。STAT3与EphrinB结合后，JAK-2磷酸化并迁移至细胞核，在细胞核中调节多种靶基因，从而调控ECs的构成[38]。另外，Salvucci等[39]研究发现EphrinB2/STAT1/JNK3信号通路对玻璃体血管的重构至关重要，JNK3活化能促进内皮细胞凋亡，而EphrinB2通过招募SHP2维持内皮细胞活力，SHP2使STAT1去磷酸化，进而抑制JNK3活性，减少促凋亡信号的产生。

PDZ结构域介导EphrinB2反向信号可能与含PDZ结合基序的蛋白质被募集到PDZ结构域有关。Ephrin/Eph反向信号通路与VEGFR通路交叉，EphrinB2可通过PDZ相互作用上调VEGFR2，而不依赖于诱导酪氨酸磷酸化，正向调控病理性血管生成[33,40]，Warren等[41]发现，PDZ结合域的缺失在生理和病理条件下使小鼠体内血管生成减少。此外，参与肿瘤细胞转移和血管生成的PI3K/AKT/mTOR和MAPK信号通路是VEGFR2介导信号通路的下游靶点，文献[42]报道塔斯品碱衍生物12k通过抑制EphrinB2的PDZ结合基序蛋白PICK1，降低EphrinB2磷酸化水平，从而影响VEGFR2信号通路。另外，在含PDZ的蛋白中，G蛋白信号转导（PDZ-RGS3）和蓬乱蛋白2（disheveled-2，Dvl2）的调控可能与PDZ介导的EphrinB2反向信号转导有关，PDZ-RGS3可能通过调节G蛋白信号通路部分介导EphrinB2反向信号通路，但下游效应蛋白目前尚不清楚[43]。

动静脉分子指纹EphrinB2/EphB4信号通路与生物学功能详见表1所示。

表1 动静脉分子指纹EphrinB2/EphB4信号通路与生物学功能Table 1 The signaling pathways and biological functions of molecular fingerprints EphrinB2/EphB4

3 总结与展望

综上所述，在静脉特异性内膜增生中VEGF-A/VEGF-R2/NRP1/COUP-TFII途径主要参与静脉分子指纹EphB4的表达调控，BMP/ALK3/SMAD1/5信号级联也可直接转录激活EphB4。以EphB4受体激活产生的正向信号，通过PI3K/AkteNOs/NO-FAK以及PI3K/Akt-NF-κB-MMP途径促进ECs迁移；PI3K/Akt-eNOs/NO-cGMP/PKGRaf/MEK/MAPK通路调控ECs增殖，此外PI3KAkt-mTOR通路，也是ECs存活、血管运动调节和屏障功能调节的关键通路。在动脉特异性内膜增生中，FOX1/VEGF-A/VEGF-R2/NRP1/PI3K-Akt/Dll4-Notch/RBPJ/EphrinB2途径主要参与EphrinB2的表达调控，以EphB4为配体结合EphrinB2后可能通过酪氨酸磷酸化依赖和 PDZ 结合结构域介导2种方式向胞内传递反向信号，调控血管生成与重构。尽管与VEGF、EphB4、EphrinB2相关的信号通路研究较为成熟，但VEGF家族中其它因子之间的相互作用以及Eph家族中其它成员与血管生成、重构的关系尚未清楚，Ephrin/Eph信号是如何与细胞骨架和基因转录相互作用也不明确，两者信号通路是否会与其他非经典途径相交叉也不得而知。对于在临床上的应用，更多也是的集中于肿瘤的抗血管生成治疗[44]以及骨缺损修复治疗，对于血管术后再狭窄的治疗并不如预期广泛，若能从动静脉特异性内膜增生信号通路上的异同出发，将动脉与静脉内膜增生区别开，针对性地阻断其中的信号通路，从而更好地解决动脉或静脉损伤后的再狭窄问题。