嗜水气单胞菌感染对黄鳝Moronecidin基因表达的影响

张钊 涂娇 张小雪

摘要：为研究嗜水气单胞菌对黄鳝Moronecidin基因表达的影响，用不同浓度嗜水气单胞菌菌液感染健康黄鳝，采用荧光定量PCR方法分别检测染菌黄鳝脾脏、肾脏和肌肉中Moronecidin基因在感染后12、24、48 h的表达量。结果表明，Moronecidin基因在健康黄鳝的上述3种组织器官中都有表达;腹腔注射嗜水气单胞菌后，该基因的表达量明显升高。随着感染时间的延长，3种组织器官中Moronecidin基因的表达量在处理1（菌液浓度为1亿CFU/mL）均呈现逐渐升高的趋势，处理2（菌液浓度为2亿CFU/mL）脾脏中Moronecidin基因的表达量随处理时间延长而逐渐升高，而肾脏和肌肉中的表达量则呈先升高后降低的趋势;处理3（4亿CFU/mL）Moronecidin基因的表达量在3种组织器官中均逐渐降低。

关键词：黄鳝;嗜水气单胞菌;Moronecidin基因

中图分类号： S917  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0188-05

鱼类依赖非特异性免疫系统通过产生各种免疫细胞[1-2]、免疫因子[3-4]等非特异性的识别并作用于病原体，达到清除体内抗原、抵御水生环境中各种病原体入侵的目的。抗菌肽（AMPs）是非特异性免疫系统的重要组成成分，存在于植物、动物以及人类等几乎所有的生命体中，具有抗菌谱广、高效、热稳定性强、不产生耐药性等特点[5-6]。研究发现，抗菌肽除了具有直接抑制细菌、真菌、病毒和原虫的抗菌活性外，还具有增强免疫细胞趋化性[7]、抑制炎症[8-9]和激活免疫细胞[10]等生物学活性。

Moronecidin抗菌肽属于Piscidin（毒鱼豆素）家族，其家族成员包括dicentracin、epinecidin、myxindin以及胸腺素[11]等。2002年Lauth等从杂交条纹鲈鱼（Hybrid striped）的鳃和皮肤中首次分离获得Moronecidin抗菌肽，并验证了它对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌活性[12];2008年Falco等的研究表明，在感染病原体后，虹鳟各组织器官中Moronecidin抗菌肽的表达量最高[13]。同时，在其他鱼类体内也相继发现了Moronecidin抗菌肽，包括大西洋鳕鱼（Gadus morhua）[14]、真鲷（Chrysophrys major）[15]、欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）[16]、石斑鱼（Epinephelus coioides）[17]等。到目前为止，Moronecidin抗菌肽仅被发现存在于鱼类中。有关Moronecidin基因的研究发现，比目鱼完整的Moronecidin基因cDNA序列包含1个信号肽和磷酸腺苷（AMP）12域[18]，而条石鲷鱼中Moronecidin基因的编码区含有204bp，共67个氨基酸残基，并预测其三级结构是一种两亲性螺旋结构[19]。前人关于Moronecidin基因的研究主要集中在海洋鱼类，而有关该基因在淡水鱼黄鳝体内表达的情况尚未见报道。

本研究以黄鳝Moronecidin基因为研究对象，通过荧光定量PCR技术检测该基因在感染嗜水气单胞菌后黄鳝脾脏等3种组织器官中的表达量变化，为进一步探讨黄鳝免疫机制，实现新型药物的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与菌株

试验用60尾黄鳝[体质量为（104.5±13.1） g]采集于贵州省贵阳市花溪地区池塘和田间;试验用嗜水气单胞菌菌株（编号：ATCC7966）由贵州大学动物科学学院陈江凤老师馈赠。

1.2 主要仪器设备和试剂

1.2.1 主要仪器设备 VD-650超净工作台、101-2型电热鼓风干燥箱、80-1电动离心机、光学显微镜CH20BIMF200、血球计数板、FA1004电子天平、78-1磁力加热搅拌器、HZQ-F160型恒温摇床、高压灭菌锅、80-2112-21型紫外分光光度仪、PTC-1148 PCR扩增仪、DYY-6C型电泳仪、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计、C1000 Touch荧光定量PCR仪、Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统。

1.2.2 主要试剂与试剂盒 无水乙醇、三氯甲烷、琼脂糖、Gold View染液[生工生物工程（上海）股份有限公司]、loading buffer[生工生物工程（上海）股份有限公司]、DM2000（鼎国生物公司）、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（TIANGEN）、TransStart Tip GreenqPCR SuperMix（TransGen Biotech）、Taq PCR Master Mix（TransGen Biotech）。

1.3 试验方法

1.3.1 菌液培養及配制 制备LB固体培养基，取储存的菌株涂抹在培养基上，经复壮后转移到液体培养基中，于28 ℃恒温摇床培养24 h，取少量菌液离心提纯，加入少量无菌生理盐水稀释后用平板活菌计数法测定菌液浓度。稀释菌液浓度至 4亿CFU/mL 备用。

1.3.2 试验分组感染 清洗养殖所用水箱，以0.7%生理盐水浸泡 1 d。将黄鳝随机分成4组，每组15尾，放入水箱用无氯水暂养2 d。对照组每尾注射0.2 mL生理盐水。其余3组为处理组，按照注射菌液的浓度分为处理1（每尾黄鳝注射02 mL浓度为1亿CFU/mL的嗜水气单胞菌菌液）、处理2（每尾黄鳝注射0.2 mL浓度为2亿CFU/mL的嗜水气单胞菌菌液）、处理3（每尾黄鳝分别注射0.2 mL浓度为 4亿CFU/mL 的嗜水气单胞菌菌液）。注射后用乙醇棉球对注射部位进行消毒，然后放入水箱中，并加盖防逃。

1.3.3 组织取样 分别在感染嗜水气单胞菌12、24、48 h后进行取材，每个浓度组各时间点分别取5尾黄鳝，解剖并分别取肾脏、脾脏、肌肉等置于无酶冷冻管中，迅速放入液氮冷冻后转入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.4 引物的设计与合成 根据转录组测序获得的抗菌肽Moronecidin基因序列，并参考GenBank中该基因序列，使用Primer Premier 5.0进行引物的设计，参照王霞等的研究结果[20]，内参基因选择黄鳝的β-actin基因。引物合成由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成，用去离子水溶解后于-20 ℃保存。引物序列信息如表1所示。

1.3.5 样品总RNA的提取及检测

1.3.5.1 总RNA的提取 使用天根生化科技（北京）有限公司生产的RNAsimple Total RNA Kit进行总RNA的提取。

1.3.5.2 总RNA的检测 对RNA样品进行超微量紫外分光光度和凝胶电泳双重检测。凝胶制备和电泳检测：称取琼脂糖0.66 g，装入锥形瓶中，加入70 mL TAE缓冲液，加热煮沸后于室温静置冷却至50 ℃左右，加入核酸染料5 μL，摇匀后迅速倒胶。将提取的总RNA样品置于冰上解凍，取1 μL loading buffer（上样缓冲液）与4 μL RNA样品混合，点样，电泳。

1.3.6 cDNA第一链的合成 选择质量较高的RNA样品进行cDNA第一链的合成，合成前将样品RNA浓度调成一致，使用天根生化科技（北京）有限公司生产的试剂盒对提取的总RNA进行反转录，按说明书步骤在冰上进行操作（为减少试验误差，保证每个反应管准确加入反应液，进行反应前将各反应液按比例混合配成混合液，再分装到各管），具体如下：

（1）将RNA样品以及反转录试剂盒内所有试剂解冻后置于冰上，使用前用漩涡振荡器混匀并简短离心。

（2）去除基因组：配制混合液（2 μL 5×gDNA缓冲液，1 μL 总RNA，用RNase-Free ddH2O补足至10 μL），充分混匀并简短离心，42 ℃条件下孵育3 min后置于冰上。

（3）配制混合液（2 μL 10×Fast RT Buffer，1 μL RT Enzyme Mix，2 μL FQ-RT Primer Mix，用RNase-Free ddH2O补足至10 μL），混匀，简短离心。

（4）将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀，简短离心，42 ℃孵育15 min。

（5）95 ℃孵育3 min后置于冰上，所得cDNA用β-actin引物进行扩增以检测质量，用于后续试验或低温保存。

1.3.7 PCR反应体系及程序

1.3.7.1 PCR反应体系 20 μL PCR反应体系如下：Taq PCR Master Mix 10 μL（1×），模板cDNA 1 μL （0.1～10 ng），Primer F（10 μmol/L） 1 μL（0.5 μmol/L），Primer R（10 μmol/L） 1 μL（0.5 μmol/L），RNase-Free ddH2O 7 μL。

1.3.7.2 Moronecidin PCR反应程序 反应程序如下：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，31个循环;72 ℃终延伸10 min。

1.3.8 琼脂糖凝胶电泳检测目的基因 称取0.66 g琼脂糖倒入锥形瓶中，加入60 mL 1×TAE缓冲液，加热煮沸溶解后，放置于室温下冷却至50～60 ℃（不烫手），加入5 μL Gold View染液，用玻璃棒搅拌均匀，迅速倒入制胶板，插入梳子。冷却凝固后取出梳子，加样，放入电泳槽，100 V电泳20 min左右，凝胶成像。

1.3.9 Moronecidin基因相对表达量的测定 以反转录所得cDNA作为荧光定量PCR的模板，对Moronecidin基因的相对表达量进行测定，建立标准曲线。反应体系和反应条件如下：

（1）荧光定量PCR反应体系。20 μL荧光定量PCR反应体系如下：10 μL 2× TransStart Tip Green qPCR SuperMix，0.4 μL（0.2 μmol/L）Primer-F，0.4 μL（0.2 μmol/L） Primer-R，2 μL模板cDNA，7.2 μL RNase-Free ddH2O。

（2）荧光定量 PCR 反应条件（两步法）。具体步骤如下：94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s，51 ℃ 30 s，39个循环，荧光信号采集;95 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，得到溶解曲线。

1.4 数据统计与分析

本试验所得实时荧光定量PCR原始数据使用2-ΔΔCT方法进行处理，分析Moronecidin基因在黄鳝肾脏等3种组织器官中的表达量。处理后的数据使用统计软件SPSS 17.0进行单因素统计分析，所得数据均为平均值±标准差，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取结果

试验共提取了108个总RNA样品。紫外分光光度计检测显示，总RNA的浓度在130～800 ng/μL之间，且D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之间，证明总RNA浓度和纯度较高。电泳检测结果显示，28S和18S条带清晰，证明总RNA完整，可用于后续PCR试验。

2.2 cDNA检测及β-actin cDNA PCR扩增结果

取1 μL cDNA，超微量紫外分光光度计测定结果显示，cDNA浓度均在1 000 ng/μL以上，且D260 nm/D280 nm值在 1.8～2.0之间，说明cDNA浓度较高且完整，可用于下一步荧光定量PCR试验。由图1可知，以反转录所得cDNA为模板，用β-actin引物进行扩增，并通过凝胶电泳成像进行检测，得到的条带分明，无杂带，每组获得的DNA片段均在 344 bp 左右，说明β-actin基因在黄鳝RNA样品中的表达稳定，可作为内参基因使用。

2.3 cDNA的PCR扩增

分别在健康黄鳝3种组织器官样品中挑选4个cDNA样品作为模板，对Moronecidin目的基因进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测并成像（图2），所得条带单一明亮，每组均扩增得到约291 bp的DNA片段，说明Moronecidin基因在健康黄鳝中有表达。

2.4 引物特异性检测

通过qRT-PCR技术检测分析感染嗜水气单胞菌后黄鳝各时间点脾脏、肾脏、肌肉组织中Moronecidin基因的表达量，得到β-actin基因扩增曲线和溶解曲线（图3）、Moronecidin基因扩增曲线和溶解曲线（图4）。由图3和图4可以看出，2个基因扩增曲线均呈“S”形，且曲线平行性好，2个基因的溶解温度分别为82.5 ℃和86.5 ℃，溶解曲线峰值单一，说明设计的荧光定量引物特异性较好，没有引物二聚体和产生非特异性扩增。

2.5 Moronecidin基因表达量的变化

以β-actin为内参作对照，在不同处理浓度和处理时间下，对Moronecidin基因在黄鳝3种组织器官中的相对表达量进行检测，检测结果采用2-ΔΔCT法进行计算，结果以对照组 12 h 的表达量为对照，设置其数值为1。

2.5.1 脾脏Moronecidin基因的表达 由图5可知，随着试验时间的推移，对照组脾脏Moronecidin基因的表达量有些许升高 但差异不明显。处理1和处理2在感染嗜水气单胞菌后，Moronecidin基因表达量均随着处理时间的延长而增加，且增加显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）;处理2在感染24 h和48 h时Moronecidin基因表达量极显著提高（P<0.01）;而处理3则随感染时间的延长，Moronecidin基因表达量与对照相比呈先升高后降低的变化趋势，且随着处理时间的延长，表达量下降十分明显。与对照组相比，各处理组Moronecidin基因表达量整体呈上调趋势，处理2在感染48 h时，基因表达量达到最高值。

2.5.2 肾脏Moronecidin基因的表达 由图6可知，随着試验时间的延长，对照组肾脏Moronecidin基因相对表达量有些许变化，但差异不明显。各处理组在感染初期，肾脏Moronecidin基因表达量均增加，随着处理菌液浓度的升高，Moronecidin基因表达量在12 h内均增加;处理2在24 h达到最高值，而处理3在12 h与对照相比增加极显著;处理2的相对表达量在12～48 h内呈先增加后降低的趋势，处理3则持续降低。

2.5.3 肌肉Moronecidin基因的表达 由图7可知，对照组肌肉中Moronecidin基因相对表达量变化不明显。与对照组相比，在感染嗜水气单胞菌后，黄鳝肌肉中Moronecidin基因表达量均升高;处理1该基因的表达量随着处理时间的增加而增加，而处理2先增加后降低，在感染24 h时该基因的相对表达量达最高值，差异极显著，但随着处理时间的延长，该基因表达量又明显下降;处理3在感染初期该基因的表达量最高，而后持续下降到对照组水平。

3 讨论

3.1 Moronecidin基因在不同鱼类器官中的表达量

研究表明，Moronecidin基因在多种健康鱼类的各组织器官（如脾脏、肾脏、肝脏、肌肉、心脏、胃等）中均有表达，但表达量的差异并不显著。用细菌或病毒诱导后，Moronecidin基因表达量显著升高，且在不同器官中的表达量变化情况不同：条石鲷（Oplegnathus fasciatus）在感染真鲷虹彩病毒后，Moronecidin基因表达量显著升高，且在脾脏中的表达量最高，在头肾和鳃中次之[19];通过注射杀鲑气单胞菌进行诱导，提高了大西洋鳕鱼（Gadus morhua）脾脏、头肾中Moronecidin基因表达量，且脾脏中24 h时的表达量变化最显著[21]。与前人的研究结果类似，本试验中Moronecidin基因在健康黄鳝的脾脏、肾脏和肌肉中均有表达，且该基因的表达量在感染嗜水气单胞菌初期均明显上调，随注射菌液的浓度升高而发生显著变化。在脾脏中该基因的表达量相比另外2种组织器官高，其次是肾脏，肌肉中的表达量相对较低。试验结果表明，在鱼类受到病菌感染时，Moronecidin基因在免疫系统中的表达量显著增加，说明其编码的抗菌肽参与了抵抗病菌的侵扰。但对于不同的鱼和感染不同的菌时，其表达量升高的时间和升高的量却有所不同。

3.2 Moronecidin基因的表达量与黄鳝脏器功能的相关性

在感染嗜水气单胞菌48 h后，处理2和处理3的3种组织器官中Moronecidin基因表达量均有下降趋势，推测原因可能是感染初期，黄鳝机体的免疫应答功能正常，Moronecidin基因表达量随着感染时间和感染菌浓度的增加逐渐增加;但在感染后期，黄鳝身体的免疫功能不敌病菌的攻击，黄鳝脏器免疫应答能力下降，导致黄鳝抗菌肽合成能力降低。这是影响Moronecidin基因后期表达量的可能原因之一。

3.3 嗜水气单胞菌感染和取材时间的确定

研究表明，黄鳝在感染嗜水气单胞菌12 h后就开始表现出出血病的症状[22]，其脏器功能受到严重损伤，72 h后全部死亡[23]。本试验根据前人的研究以及预试验的情况，选择在48 h内取材，以避开染菌黄鳝全部死亡而无材料可取的问题。

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