分泌尿鸟苷素工程菌的构建及其对结肠上皮细胞cGMP合成的影响

李林 魏振宇 尉秀清

【摘要】目的构建能够分泌尿鸟苷素的婴儿双歧杆菌，观察其对结肠上皮细胞环磷酸鸟苷（cGMP）合成的影响，为用尿鸟苷素基因重组双歧杆菌治疗便秘做前期准备。方法以质粒pBV220为模板，构建表达质粒pBV220-ESS-uroguanylino重组质粒pBV 220-ESS-uroguanylin电击转化婴儿双歧杆菌。用ELISA检测重组婴儿双歧杆菌中尿鸟苷素的表达情况及其上调结肠癌细胞T84内cGMP合成的能力。结果pBV 220-ESS-uroguanylin阳性克隆提取质粒并进行基因测序，证实载体构建成功，测序正确无突变。ELISA检测证实重组婴儿双歧杆菌成功表达尿鸟苷素，具有上调结肠癌细胞T84内cGMP合成的能力。结论重组双歧杆菌构建成功并能分泌尿鸟苷素，提高结肠上皮细胞cGMP的合成。

【关键词】尿鸟苷素;双歧杆菌;环磷酸鸟苷

尿鸟苷素是小肠黏膜细胞分泌的一种具有调节肠道水钠代谢作用的16肤[1]。尿鸟苷素作用于小肠黏膜上皮细胞鸟苷酸环化酶2C受体，使细胞内第二信使环磷酸鸟苷（cGMP）含量升高，进而激活蛋白激酶A，使囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）磷酸化，增强氯离子和碳酸氢根离子的跨膜转移，使肠腔内氯离子和碳酸氢根离子分泌增加，从而导致水钠分泌增加、肠道蠕动能力增强，此生理作用可显著改善慢性便秘及便秘型肠易激综合征[2]。

随着益生菌潜在健康益处被挖掘和基因工程技术的进步，选择益生菌作为载体系统，表达特定功能的蛋白质，探索其在疾病治疗领域的应用潜力越来越受重视。双歧杆菌是人类肠道重要的菌群。越来越多的研究对重组双歧杆菌在疾病治疗、疫苗制作以及对人类有益的功能性蛋白的分泌领域进行初步探索[3]。婴儿双歧杆菌ATCC 15697已应用于乳制品和食品领域，是一种安全的食用菌。我们将尿鸟苷素基因重组到质粒pBV220中，使其在宿主菌婴儿双歧杆菌中表达，然后进一步验证其是否能够增加结肠癌细胞T84内cGMP的合成，从而为该重组婴儿双歧杆菌具有通过cGMP-蛋白激酶A-CFTR调节轴而影响水钠代谢的能力提供实验依据，为后期研究其是否能作为一种治疗便秘的生物制剂做前期准备。

材料与方法

一、细胞、菌种与质粒

婴儿双歧杆菌ATCC 15697购自广东省微生物菌种保藏中心，pBV220质粒购自武汉森灵生物科技有限公司，结肠癌T84细胞由中山大学附属第三医院消化内科实验室保存，含有pBV220质粒的婴儿双歧杆菌ATCC 15697（前期已构建，由暨南大学第二理工楼734姚冬生教授实验室保存）。

二、主要试剂和仪器

1.主要试剂

限制性内切酶（Neb，美国），尿鸟苷素ELISA试剂盒（Cusabio，武汉），cGMP ELISA试剂盒（Elabscience，武汉），TPY液体/固体培养基（海博生物公司，青岛），ActilightP（日本Meiji公司，由上海格信企业赠送），质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）。

2.主要仪器

多功能酶标仪（美谷分子仪器，上海），ECM399电转仪（BTX，美国），DYY-10型电泳仪（六一仪器厂，北京），Mini离心机（Eppendorf公司，德国）。

三、实验方法

1.pBV220改造

从NCBI获得相关基因序列信息后，按图1设计交由上海捷瑞生物工程有限公司全基因合成并组装载体，获得由质粒pBV220改造后得到的质粒pBV220-ESS-uroguanylino pBV220质粒由我国预防医学院病毒研究所自行构建，属于温度诱导表达型，诱导温度为42℃[4]。

2.重组质粒转化婴儿双歧杆菌

将婴儿双歧杆菌用TPY培养基37℃厌氧培养48 h，按1：10接种于TPI培养基，37℃厌氧培养12h，再按1：20接种到120ml含有16% Actilight.P的TPY培养基培养中，12～16h后吸光度（OD）。

ESS序列包含了amy B基因（青春双歧杆菌INT57的淀粉酶基因）中的启动子、核糖体结合位点以及信号肽区域（参考序列GenBank編号：AY240946.1）：Uroguanylin为尿鸟苷素成熟肽序列（序列前加ATG，末尾加TAA，参考序列NCBI编号为NM 007102.3）;上述目的基因序列通过EcoR I和Pst I双酶切连接到质粒pBV220的多克隆位点上;所有工作委托上海捷瑞生物工程有限公司完成值达到0.2～0.3，8000转/分4℃离心10min，去除上清后用pH为7的5mmol几磷酸钾缓冲液洗3次，用1ml KMR缓冲液（5mmol/L磷酸二氢钾，1mmol/L氯化镁，0.3 mol几棉子糖）重悬细胞，0℃过夜。取100μl细胞悬液与0.25μg重组质粒pBV220-ESS-uroguany&n混合，转移至电击杯，冰浴5min，12.5 kV/cm电击，立即用5ml含有16%Actilight■P的TPI培养基复苏细菌，37℃厌氧培养16h（电转化方法参考Rossi等[5]研究）。将菌液涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素的TPY固体平板，37℃厌氧培养48h，同时接种另一组未转染抗性质粒的婴儿双歧杆菌至同样含氨苄青霉素的平板上作为阴性对照。48h后挑取阳性克隆接种至10ml TPY液体培养基，厌氧培养48h，离心去除上清，用50mg/ml的溶菌酶37℃处理菌体2h，离心取上清，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒用EcoR I和Pst I双酶切鉴定，质粒pBV220作为阴性对照。

3.尿鸟苷素ELISA试剂盒检测尿鸟苷素基因在双歧杆菌的表达

将空白对照组（野生型婴儿双歧杆菌ATCC15697）、空载对照组（含有pBV220质粒的婴儿双歧杆菌ATCC 15697双歧杆菌，前期已构建）、重组质粒组（含重组质粒pBV 220-ESS-uroguanylin的婴儿双歧杆菌ATCC 15697）用TPY培养基37℃厌氧培养36h，然后再42℃厌氧培养16h，离心取上清液作为检测样本。按尿鸟苷素ELISA试剂盒说明书要求进行检测，简要步骤如下：室温下平衡各种试剂1h;分别加标准品、各组细菌培养的上清液100μl/孔，37℃孵育2h;去除孔内液体;每孔加生物素标记抗体100μl，37℃孵育1h;洗板3次：每孔加HRP-avidin100μl，37℃孵育-h;洗板5次;每孔加TMB底物90μl，37℃避光孵育20～30min：每孔加入终止液50μl。用多功能酶标仪检测反应物的OD₄₅₀。

4.cGMP ELISA试剂盒检测工程菌分泌的尿鸟苷素的生物活性

将含重组质粒pBV 220-ESS-uroguanylin的双歧杆菌（重组质粒组）37℃培养36h，然后再42℃诱导表达16h，同样方法培养野生型双歧杆菌（空白对照组）和含有pBV220质粒的双歧杆菌（空载对照组）。在4个6孔板用含有10%胎牛血清的DMEM洗2次培养结肠癌细胞T84，48h后吸去每孔的培养基，然后每孔加入1ml含10%胎牛血清的DMEM洗2次;每孔再加入1ml含10%胎牛血清和1mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的DMEM、37℃孵育1h;然后将各组细菌培养上清液加入到孔板中（每组菌液上清分别加8个孔，每孔1ml），孵育1h。去除培养液，每孔加入一ml lmol/LHCl 20℃孵育30min，裂解细胞获得cGMP（该方法参考Cuppoletti等[6]提取肿瘤细胞cGMP的步骤）;离心取上清液用cGMP ELISA试剂盒检测工程菌分泌的尿鸟苷素的生物活性，简要步骤如下：每孔加入标准品或样品各50μl，立即加入50μl生物素化抗体工作液，37℃孵育45min;洗涤3次;加人100μl酶结合物工作液，37℃孵育30min;洗涤5次;加入90μl底物溶液，37℃孵育15min左右;加入50μl终止液，立即用多功能酶标仪检测反应物的OD₄₅₀。

四、统计学处理

应用SPSS 21.0进行统计学分析。实验数据的计量资料以x1s表示，方差不齐，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两两比较用Bonferroni法校正检验水准，α=0.05。

结果

一、重组质粒转化婴儿双歧杆菌

重组质粒pBV 220-ESS-uroguanylin电转化后的双歧杆菌在含有100μg/ml氨节青霉素的平板长满了单克隆菌落，而野生型双歧杆菌（空白对照组）在含有100μ/gml氨苄青霉素的平板没有菌落生长，重组质粒成功转化双歧杆菌，见图2。为了进一步验证重组质粒已经转人双歧杆菌，用试剂盒提取阳性克隆的质粒后与阴性对照质粒pBV220同时做双酶切验证，见图3。双酶切验证结果进一步证明重组质粒pBV220-ESS-uroguanylin成功转化婴儿双歧杆菌。

1为DNA Marker DL10004：2为对照组质粒pBV220、双酶切获得3666bp大小的片段;3为阳性克隆的质粒，双酶切获得3666bp和714bp 2个片段

二、各组别尿鸟苷素表达情况

各组细菌尿鸟苷素表达情况ELISA检测结果显示：重组质粒组反应终产物OD₄₅₀（0.29±0.03）分别与空白对照组反应终产物OD₄₅₀（0.06 1 0.01）和空载对照组反应终产物OD₄₅₀（0.07±0.02）比较差异均有统计学意义（Z分别为-3.733和-3.016、P均<0.05/3）;而空白对照组OD₄₅₀和空载对照组OD4so比较差异无统计学意义（Z=-0.672，P=0.501）。

已知野生型婴儿双歧杆菌不会分泌尿鸟苷素，因此可以证明含重组质粒pBV 220-ESS-uroguanylin的双歧杆菌成功分泌尿鸟苷素。含重组质粒pBV220-ESS-uroguanylin的双歧杆菌尿鸟苷素表达量的计算方法为：重组质粒组OD4so一空载对照组OD。。，然后通过标准曲线及拟合方程（由标准品检测结果通過软件OriginPro 8.0用4参数Logistic拟合进行回归分析获得标准曲线及拟合曲线，见图4）计算出重组婴儿双歧杆菌尿鸟苷素表达量约为652.23 pg/ml（约0.38 nmol/L）。

三、各组别尿鸟苷素的生物活性检测情况

尿鸟苷素的生物活性是通过其上调cGMP的作用达到的，采用cGMP ELISA试剂盒检测。因该试剂盒采用的是竞争抑制ELISA，因此反应终产物的OD₄₅₀和cGMP浓度成反比。

各组细菌ELISA检测结果显示：重组质粒组反应终产物OD4so（0.05±0.00）分别与空白对照组

通过标准品获得相应浓度（作为因变量）下的OD值（作为自变量），通过软件OriginPro 8.0用四参数Logistic拟合进行回归分析，获得尿鸟苷素ELISA标准曲线，其方程为y=d-（a+d）/[1+（x/c）b]（a=0.007，b=0.932，c=3.525，d=5840.3），r²=0.999，检测范围31.25一2000pg/m反应终产物OD₄₅₀（0.43±0.02）和空载对照组反应终产物OD₄₅₀（0.41±0.03）比较，差异均具有统计学意义（Z分别为3.683和3.116，P均<0.05/3）;而空白对照组OD₄₅₀和空载对照组OD、、比较差异无统计学意义（Z=0.567，P=0.571）。

竞争抑制ELISA的反应终产物的OD₄₅₀和cGMP浓度成反比，即重组质粒组的cGMP含量较对照组升高，且具有统计学意义，结合上一步尿鸟苷素表达检测结果，可以证明重组婴儿双歧杆菌分泌表达的尿鸟苷素导致了cGMP的升高，具有和人体天然分泌的尿鸟苷素相同的生理活性。

讨论

便秘是一种常见的以排便功能障碍为特征的疾病。流行病学调查显示，世界各地便秘的平均患病率为16%左右，而60岁以上患病率升高至30%以上[7。女性患病率是男性的4倍以上[8]。便秘的高患病率和便秘治疗药物的高使用频率给患者的生活质量带来了严重影响，同时造成了巨大的社会经济负担和医疗资源的占用。寻找安全、方便、有效、物美价廉的便秘治疗药物是重要研究课题。

自从联合国粮食及农业组织和WHO将益生菌定义为“数量控制在适当范围内对宿主健康有益的微生物”以来，益生菌的商业应用和研究越来越多[9]。而随着基因工程技术的进步，通过基因编辑技术获得具有促进人类健康或治疗疾病的能力的功能性益生菌将成为未来的一种趋势[10]。

我们课题组利用基因工程技术，将尿鸟苷素基因表达于益生菌中，从而获得具有调节肠道水钠分泌功能的益生菌，并进一步探究基因工程益生菌在便秘防治中的可行性，以期获得一种具有治疗便秘功能的益生菌，为慢性便秘防治提供一种多元化的经济有效的策略。

本文所介绍的用质粒pBV220将尿鸟苷素基因表达于婴儿双歧杆菌ATCC 15697为本研究的前期预实验部分。本课题组已成功构建了一种能稳定分泌表达尿鸟苷素的婴儿双歧杆菌ATCC巧697;且该重组菌分泌的尿鸟苷素和人类肠道天然分泌的尿鸟苷素一样，可上调肠上皮细胞cGMP的含量。而研究已经表明尿鸟苷素可通过上调细胞内第二信使cGMP的含量，进而通过蛋白激酶A-CFTR调节轴，最终使氯离子和碳酸氢根离子的跨膜转移增加，导致肠道水钠分泌增加、肠道蠕动能力增强。因此可认为重组婴儿双歧杆菌具有促进肠道排泄功能的潜力。

后期实验中，可通过基因编辑技术将重组质粒pBV 220-ESS-uroguanylin中温控基因cItS857删除，从而获得能够在人体正常体温下表达尿鸟苷素的重组菌，然后让其在人体肠道定植。因为重组菌分泌的尿鸟苷素为纳米级，作用相对温和，如果让其定植在人类肠道，可能可以作为一种定植菌而达到长期促进肠道粪便排泄的效果，需后期实验进一步探究。

参考文献

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（收稿日期：2019-01-18）

（本文编辑：杨江瑜）

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2019.05.005

基金项目：国家自然科学基金（81470848）

作者单位：510630 广州，中山大学附属第三医院消化内科