高频电刺激对癫痫模型大鼠慢性期海马苔藓纤维出芽及痫性发作影响

洪全龙　陈圣根　黄文立　杨美青

【摘要】 目的：局部注射海人酸制作癫痫大鼠模型，研究局部高频电刺激对癫痫大鼠苔藓纤维出芽及痫性发作的影响。方法：海马局部注射海人酸制作大鼠颞叶癫痫模型，选择局部海马癫痫灶进行高频电刺激，选择不同时间点，观察大鼠癫痫发作特点及脑电变化，通过改良Timm染色法，观察海马病理改变。结果：行为和脑电变化，点燃大鼠行为学上可分三期，包括急性期、静止期、慢性期，同时各个时期有相应的脑电特征表现。电刺激可减少慢性期大鼠癫痫发作的次数和痫性放电的次数（P<0.001）。病理改变，点燃后大鼠海马Timm染色可见4 d时苔藓纤维出芽开始出现，到14 d最明显（P<0.01），Golijeh评分电刺激组较海人酸组低（P<0.05）。结论：局部高频电刺激海马能有效抑制海人酸癫痫模型大鼠的癫痫发作及痫性放电，抑制海马苔藓纤维出芽可能是高频电刺激控制癫痫发作的作用机制之一。

【关键词】 海人酸; 高频电刺激; 颞叶癫痫; 苔藓纤维出芽

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.05.002 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）05-000-04

The Effects of High Electrical Stimulation on Mossy Fiber Sprouting and Epileptic Seizure in the Hippocampus of Model Rat/HONG Quanlong，CHEN Shenggen，HUANG Wenli，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（5）：-6

【Abstract】 Objective：In this study，the effects of electrical stimulation on mossy fiber sprouting and epileptic seizure in chronic epileptic rats were investigated by establishing the model of chronic epileptic rats with Kainic acid.Method：The temporal lobe epilepsy models were established with unilateral Kainic acid injections.Local hippocampal epileptic foci were selected for high-frequency electrical stimulation.Different time points were selected to observe the seizure characteristics and EEG changes in rats，the pathological changes of hippocampus was investigated by Timm staining.Result：Behavior and EEG，the behavior of ignited rats can be divided into three phases，including acute phase，quiescent phase and chronic phase，in the three periods，the characteristic of EEG were recorded.HFS may reduce the spontaneous recurrent seizures and epileptic discharge in the chronic phase（P<0.001）.Pathology，the Timm staining of the rat hippocampus showed that the mossy fiber sproutings evidence was found at 4 days following induction of SE，and was vigorous at 14 days（P<0.01）.IN the Golijeh score，electrical stimulation group was lower than the KA group（P<0.05）.Conclusion：High electrical stimulation of hippocampus can effectively inhibit seizures and epileptic discharge in rats with Kainic acid epilepsy.Inhibition of hippocampal mossy fiber sprouting may be one of the mechanisms of high-frequency electrical stimulation to control epileptic seizures.

【Key words】 Kainic acid; High electrical stimulation; Temporal lobe epilepsy; Mossy fiber sprouting

First-authors address：Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China

在癲痫治疗中，有30%的患者药物控制不理想，发展成难治性癫痫[1]。脑深部电刺激术作为难治性癫痫治疗有效手段，目前机制还不清楚，苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting，MSF）被认为颞叶癫痫一个重要的病理学特点，这些异常突触建立起海马兴奋环路，对异常放电的产生及扩散起到了易化作用[2]。本研究采用海马区局部注射海人酸，建立颞叶癫痫模型;电刺激（130 Hz）局部海马癫痫灶，观察和对比不同时间点大鼠行为、脑电和海马病理变化。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：购自中国上海斯莱克实验动物有限公司SD清洁级雄性成年大鼠（体重250～300 g，10～13周龄）。

1.2 实验方法及步骤

1.2.1 动物分组 将大鼠分为电刺激组（n=25）、点燃组（n=40）、电极植入组（n=25）、空白组（n=8）。共98只大鼠纳入实验。

电刺激组：注射海人酸后植入电极，大鼠癫痫发作大于Ⅳ级，且发作大于3次，脑电图描记到有痫性放电，给予电刺激治疗。点燃组：注射海人酸后未植入电极，大鼠癫痫发作大于Ⅳ级，且发作大于3次，脑电图描记到有痫性放电。电极植入组：相同部位植入电极，注入生理盐水，连接刺激器，不予刺激。空白组：正常雄性成年大鼠。

1.2.2 模型的建立及电极植入 术前1 h，配制海人酸（0.4 μg/μl），

选择右侧海马腹后部CA3区，取海人酸1.0 μl（电极植入组抽取超纯水1.0 μl），缓慢注射，沿注射孔道，将刺激电极缓慢植入，定位于右侧海马CA3区。同侧额区（P 2.5 mm，L 2.0 mm，D 0.5 mm）作为记录电极位置，枕骨棘中央作为参考电极。牙托粉和502胶水固定。单笼饲养。

1.2.3 大鼠行为学观察 按Racie癫痫行为分级法[3]，术后14 d每日记录点燃大鼠发作级别及发作次数。纳入实验点燃大鼠标准：确认有癫痫发作Ⅳ级以上发作连续出现3次以上。

1.2.4 视频脑电图描记皮层脑电 使用常规脑电图记录痫性放电次数，描记时间在术后1、4、7、14 d進行，电极放置位置如上述。

1.2.5 电刺激干预 使用YC-2型程控电刺激器;刺激参数：强度500 μA，波宽0.05 ms，频率130 Hz;刺激时间30 min，最长14 d。

1.2.6 组织取材 点燃组（n=10）和空白组（n=2）1、4、7、14 d每个时间段随机取材组织制备，其中一组用于病理学观察，另一组取材备用。电刺激组和电极植入组1、4、7 d

（n=5）时取材冷藏备用，14 d（n=10）随机取材组织制备，其中一组组织制备用于病理学观察，另一组组织取材冷藏备用。病理观察用改良Timm染色，判断标准依据Golijeh评分[4]，Golijeh评分依据Timm颗粒分布，从无到致密共分为0～Ⅴ级。

1.3 统计学处理

分析采用SPSS 19.0统计软件包。实验数据经检验符合正态分布和方差齐性，采用均值士标准差（x±s），组间采用单因数方差分析;若实验数据不符合正态分布和方差齐性，采用非参数检验。等级资料采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学观察及视频脑电图记录大鼠脑电变化

电极植入组和空白组未见癫痫发作。点燃组点燃的大鼠行为症状表现可分为急性期、静止期和慢性期。同时记录到不同时期的脑电特点（如图1～图4），这与人类颞叶癫痫的临床病程特点相似。结果发现电刺激组发作及痫性放电次数较点燃组少（P<0.001），见表1。

2.2 Timm 染色观察大鼠海马苔藓纤维出芽

2.2.1 点燃组致痫后1、4、7、14 d 不同时间点苔藓纤维出芽变化观察 如图5，在致痫后随着时间延长，可观察到齿状回内分子层的MFS颗粒由零星分布到浓染成层状，14 d 时尤为明显。

2.2.2 苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting，MFS）不同时点半定量分析 比较不同时间段Golijeh评分，详见表2。结果提示点燃后1～4 d MFS较稀疏（Golijeh评分0～Ⅱ级），7 d明显增多（Golijeh评分Ⅲ～Ⅴ级），14 d时最明显。

2.2.3 各实验组14 d时苔藓纤维变化观察 如图6，点燃组14 d，Timm颗粒在齿状回，呈连续分布，而非点燃组大鼠（空白组和电极植入组）齿状回Timm 染色颗粒，呈零星分布，或无分布。

2.2.4 14 d时各组MFS半定量分析 比较各组Golijeh评分，见表3。结果提示电刺激组苔藓纤维出芽Golijeh评分Ⅱ～Ⅳ级，较点燃组Ⅳ～Ⅴ级低。

3 讨论

本实验采用单侧局部注射KA于大鼠HP腹后侧后部的方法造成局限性癫痫灶，行为上与人类颞叶癫痫的临床病程特点相似[5]。苔藓纤维出芽（mossy fiber sprouting，MFS）是颞叶癫痫中标志性的轴突出芽，突出的病理表现。这些异常突触的形成，促进了海马兴奋性环路的建立，同时对痫性放电的产生及扩散起到了易化作用。动物癫痫模型研究提示，苔藓纤维出芽与癫痫的自发发作关系密切，容易出现自发癫痫的动物，其海马苔藓纤维出芽出现早，且MFS较多。没有自发癫痫或症状轻的动物，海马组织发现MFS并不明显[6-7]。同时在人类颞叶癫痫组织病理检查中，也发现MFS与癫痫形成有关[8-9]。本实验观察到不同时间段海人酸模型，海马苔藓纤维出芽的病理变化过程，在点燃4 d时，内分子层可见有Timm颗粒的沉积，在7 d已较明显，14 d时尤为显著，结合慢性期行为学和脑电的变化，说明KA模型中MFS与KA诱发的自发性癫痫发作密切相关。

实验证明，海马在颞叶癫痫的启动和传播扮演很重要的角色，同时在海马最先可检测痫样放电[10-11]。在癫痫模型动物研究中，Wyckhuys等[12]通过对大鼠海马高频电刺激，发现海马后放电（after discharges，AD）阈值提高，潜伏期变长，时程缩短。表明高频电刺激海马有降低异常通路的兴奋性，增强潜在的抑制作用，从而减少异常放电。在人类对颞叶癫电刺激治疗研究中，Cukiert等[13]用海马深部电刺激治疗了9名难治性颞叶癫痫患者。其中单侧海马硬化使用单侧DBS并且癫痫发作频率减少了76%～80%。双侧海马硬化患者（n=4）接受双侧植入。其中3名患者接受单侧刺激，癫痫发作频率降低66%～100%。本研究中发现，在对KA致痫大鼠进行高频电刺激，大鼠自发性癫痫发作次数明显减少，发作级别降低，同时脑电显示异常放电明显减少，提示海马癫痫灶高频电刺激，对癫痫发作及异常放电有抑制的作用[14]。

腦深部电刺激术（deep brain stimulation，DBS）治疗癫痫的作用机制仍不清楚[15]，目前包括电流直接作用于颅内特定结构引起的局部抑制及从刺激部位投射到其他中枢神经结构产生投射抑制效应。根据上述可能的作用机制，有四种假想被提出，包括去极化阻滞、突触抑制、突触阻抑、刺激改变了病理性神经网络功能。本研究结果提示，高频电刺激海马癫痫灶在一定程度上抑制海马苔藓纤维异常出芽，致痫后14 d，Timm颗粒Golijeh评分电刺激组较点燃组低（P<0.05）。由此考虑，高频电刺激控制癫痫发作的作用机制之一是通过抑制海马苔藓纤维出芽，防止异常兴奋环路的建立，降低痫样放电和癫痫发作敏感性。电刺激通过何种方式抑制海马苔藓纤维异常出芽有待进一步研究。

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