正交试验优选藤龙补中方水提工艺*

许聪聪 ，王晓晗 ，梁惠芬 ，林 鹭 ，安红梅 ，胡 兵 ，浦益琼 ，张 彤

（1.上海中医药大学教学实验中心，上海 201203； 2.上海中医药大学中药学院，上海 201203；3.上海中医药大学附属龙华医院，上海 201203）

藤龙补中方系上海中医药大学附属龙华医院的临床验方，主要用于治疗大肠癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤，由藤梨根、龙葵、蛇莓、白术、茯苓、薏苡仁、槲寄生、半枝莲等中药组方[1]。目前，藤龙补中汤配合手术、化学治疗（简称化疗）等方式联合治疗大肠癌，疗效明显[2-4]。藤龙补中汤可促进结肠癌细胞的衰老，抑制大肠癌细胞的转移，降低化疗不良反应，促进大肠癌患者胃肠道功能的恢复[5-7]。在确保原方疗效的同时，通过优化提取工艺可制备成固体制剂。本研究中以中医药理论为指导原则，在不改变提取溶剂的基础上，以浸膏得率、野黄芩苷、对羟基桂皮酸和多糖含量为考察指标，对藤龙补中方的水提工艺进行优选，为复方颗粒剂的研究提供样品和技术积累。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；BS-124S型电子天平（德国赛多利斯公司）；101-2-5型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；XS105DU型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

试药：藤梨根、龙葵、蛇莓、白术、茯苓、薏苡仁、槲寄生、半枝莲（上海康桥中药饮片有限公司，批号分别为161011，161223，160111，160818，160823，170117，160624，161223），经上海中医药大学中药学院张红梅博士鉴定为正品，均符合2015年版《中国药典（一部）》相关要求；D-无水葡萄糖对照品（批号为110833-201506），野黄芩苷对照品（批号为110842-201709），均购自中国食品药品检定研究院；对羟基桂皮酸对照品（上海誉恩生物科技有限公司，批号为7400-08-0）；甲醇（批号为 R6AG1H）、乙腈（批号为 S8HA1H）均为色谱纯（Honeywell公司），其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

图1 高效液相色谱图

2 方法与结果

2.1 野黄芩苷含量测定[8]

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：DiamonsilTMPlus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.1% 磷酸溶液（39 ∶61）；流速：1.0 mL/min；检测波长：335 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下的色谱图见图1。

2.1.2 溶液制备

取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为1.028 g/L的对照品贮备液。取浸膏粉约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇溶液100 mL，超声10 min，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：取对照品贮备液适量，加甲醇制得质量浓度分别为 8.224，20.56，51.4，128.5，257，514，1 028 μg/mL的系列对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，以质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程Y=30.919X-0.613 36，r=0.9995（n=7）。结果表明，野黄芩苷质量浓度在8.224～1028g/L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：分别精密吸取质量浓度为20.56，128.5，514 μg/mL 对照品溶液，各 10 μL，注入液相色谱仪，连续测定6次。结果的RSD分别为1.31%，0.69%，0.23%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取浸膏，平行测定6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果的RSD为1.44%（n=6），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

重复性试验：取浸膏，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果平均含量为1.42%，RSD为1.53%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的浸膏9份，分别加入相当于样品含量50%，100%，150%的对照品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=3）

2.2 对羟基桂皮酸含量测定[9-10]

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：UltimateXB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈 -0.2%醋酸溶液（14∶86）；流速：1.0mL/min；检测波长：300 nm；柱温：25 ℃ ；进样量：10 μL。在此色谱条件下的色谱图见图1。

2.2.2 溶液制备

取对羟基桂皮酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为1.04 g/L的对照品贮备液。取浸膏粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇溶液25 mL，超声20 min，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：取对羟基桂皮酸对照品贮备液适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.784 375，1.568 75，3.137 5，6.275，12.55，25.1，50.2 μg/mL 的系列对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，以质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程Y=70.579X-17.853，r=0.999 9（n=7）。结果表明，对羟基桂皮酸质量浓度在0.784 375～50.2 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：分别精密吸取质量浓度为1.568 75，6.275，25.1 μg/mL 的对照品溶液，各 10 μL，注入液相色谱仪，连续测定6次。结果的RSD分别为1.18%，1.17%，0.42%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，按拟订色谱条件于24 h内间隔一定时间进样6次。结果的RSD为2.00%（n=6），表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

重复性试验：取浸膏，平行6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果平均含量为0.026 4%，RSD为1.52%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的浸膏9份，分别加入相当于样品含量50%，100%，150%的对照品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果见表1。

2.3 多糖含量测定[6，11-12]

2.3.1 溶液制备

取干燥至恒定质量的D-无水葡萄糖对照品8.77mg，置10 mL容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，配制成质量浓度为877 μg/mL的对照品贮备液。取浸膏粉约0.1 g，精密称定，加5 mL水使其完全溶解，加入95%乙醇，搅拌均匀，4℃冰箱静置过夜，过滤，沉淀用95%乙醇洗涤3次，干燥。将干燥后的沉淀全部溶解于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤，即得供试品溶液。

2.3.2 测定方法

取供试品溶液1.0 mL，置试管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，混匀，沸水浴中加热15 min后，迅速冷却至室温，于487 nm波长处测定吸光度，计算多糖含量。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：取葡萄糖对照品贮备液适量，加水制备成质量浓度 分别 为 19.294，29.818，38.588，49.989，70.16，79.83 μg/mL 的系列对照品溶液，精密吸取1.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，混匀，沸水浴中加热15 min后，迅速冷却至室温，以相应试剂为空白，于487 nm波长处测定吸光度（A）值，以 A（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y=9.9X+12.9，r=0.999 7（n=6）。结果表明，D-无水葡萄糖质量浓度在19.294～79.83 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：分别称取质量浓度为29.818，49.989，79.83 μg/mL的对照品溶液适量，按拟订色谱条件测定吸光度，连续测定6次。结果的RSD分别为0.11%，0.15%，0.03%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，按拟订色谱条件于24 h内间隔一定时间测定6次。结果的RSD为2.70%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取浸膏，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定吸光度。结果平均含量为13.49%，RSD为2.47%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的浸膏9份，分别加入相当于样品含量50%，100%，150%的对照品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定。结果见表1。

2.4 水提工艺优选

选择浸泡时间（因素A）、加水量（因素B）和提取时间（因素C）为考察因素[13]，以浸膏得率（指标Ⅰ）、野黄芩苷（指标Ⅱ）、对羟基桂皮酸（指标Ⅲ）及多糖（指标Ⅳ）含量的综合评分为考察指标，权重系数设为0.25。称取处方量药材，按L9（34）正交表设计试验，试验安排及结果见表2，方差分析见表3。

表2 藤龙补中方水提工艺正交试验分析

表3 水提工艺方差分析

由方差分析可知，因素A（温度）、因素B（溶剂用量）和因素C（提取时间）均对结果的影响无显著性，因此采用直观分析结果。各因素的最佳搭配为A3B2C1，即采用浸泡0 h，溶剂用量（10+8）倍，提取时间2 h；为节约能源，溶剂用量不变，提取时间调整为1 h。

按优选的水提工艺提取，经3批验证试验，所得浸膏中野黄芩苷、对羟基桂皮酸和多糖含量分别为1.39%，0.027 9%和15.25%，RSD分别为 2.79%，0.67%和2.82%，浸膏得率为15.89%，RSD为1.78%（n=3），表明该水提工艺稳定、可行。

3 讨论

测定野黄芩苷含量时，曾分别考察了提取溶剂（50% ，70% ，100%甲醇）、溶剂用量（10，25，50，100 mL）及超声时间（10，20，30 min）对野黄芩苷提取率的影响。结果表明，当取样量为0.25 g，提取溶剂为50%甲醇100 mL，超声提取10 min，野黄芩苷提取率较高。

测定对羟基桂皮酸含量时，也曾分别考察了提取溶剂（50%，70% ，100% 甲醇）、溶剂用量（10，25，50 mL）及超声时间（10，20，30 min）对对羟基桂皮酸提取率的影响。当取样量为0.2 g，提取溶剂为50%甲醇50 mL，超声提取20 min，对羟基桂皮酸的提取率较高。

野黄芩苷为半枝莲的主要成分，在该成分的测定过程中，先采用与2015年版《中国药典（一部）》半枝莲药材项下含量测定方法一致的甲醇-水-醋酸（35∶61∶4，V∶V∶V）流动相进行测定，由于野黄芩苷色谱峰与相邻峰未分开，未达到要求。初步考虑该复方成分较复杂，可能是某类黄酮类化合物对其造成了影响，需重新调整流动相。现行药典中灯盏细辛含有野黄芩苷，以甲醇-0.1%磷酸溶液（40∶60，V∶V）为流动相，并根据具体情况将流动相调整为甲醇-0.1%磷酸溶液（39∶61，V∶V），可获得较好的色谱峰分离效果。

在建立了3种活性成分含量测定方法的基础上，以综合评分法优选该方的水提工艺。选定的3个指标成分中，野黄芩苷和多糖成分的抗肿瘤作用显著。半枝莲中的黄酮类化合物在体内外都有显著的消除自由基的作用[14]，对人结肠癌细胞株SM480有抑制作用[15]；此外，该复方水提物中含有大量多糖成分，也具有良好的抗肿瘤作用。其中，半枝莲多糖能抑制HepA小鼠肿瘤生长，降低H22肝癌小鼠瘤重[16]，提高C26结肠癌小鼠的肿瘤组织凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的活性发挥抗肿瘤作用[17]；茯苓多糖对胃癌、乳腺癌、肝癌均能起到一定的抑制作用[18]；藤梨根中的有效成分猕猴桃根多糖可通过抑制PCNA蛋白的过速增殖而抑制结肠癌和肝癌的增殖[19]；龙葵多糖能显著抑制小鼠U14细胞的增殖，延长荷瘤小鼠的生存时间，是治疗宫颈癌的有效物质，龙葵中分离得到的糖蛋白类成分能抑制结肠癌细胞HT-29和HCT-116细胞株的增殖，提示该药中糖蛋白类成分可能是抗结肠癌的药效物质[20]。