响应面法优化葡萄微嫁接组培快繁体系

李雪雪 郭雯岩 周璇 赵伟 牛铁泉 纪薇

摘要：为提高鲜食葡萄苗木品质和良种繁育速度，以鲜食葡萄品种晶红宝为试验材料，探究培养基天然营养添加物的种类及浓度、外植体消毒时间、光周期、微嫁接方法和绑缚材料等因素对葡萄微嫁接苗成活率的影响，结合响应面法确定葡萄微嫁接苗组培最佳试验条件，优化葡萄微嫁接组培快繁体系。结果表明，MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂培养基（pH 5.8～6.0）中添加香蕉泥可显著降低微嫁接苗的褐变率和污染率，促进不定根的伸长。响应面分析进一步确定了葡萄微嫁接组培的最佳试验条件为氯化汞消毒7.1 min，光照17 h，香蕉泥浓度700 mg/L。在此基础上采用劈接法、锡箔纸作绑缚材料的葡萄微嫁接苗成活率显著高于其他处理。

关键词：葡萄;组织培养;微嫁接;响应面分析

中图分类号：S663.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）09-0069-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.016           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： In order to improve the quality of fresh grape seedlings and the breeding speed of fresh varieties， the fresh grape variety Jinghongbao was used as the experimental material to explore the effects of factors such as the type and concentration of natural nutrient additives， disinfection time of explants， photoperiod， micro-grafting methods and binding materials on the survival rate of grape micro-grafted seedlings. The best experimental conditions for grape micro-grafted seedlings were determined by response surface methodology， and the grape micro-grafting tissue culture rapid propagation system was optimized. The results showed that the addition of banana mud in MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L sucrose+7.0 g/L agar medium（pH 5.8～6.0） could significantly decrease the browning rate and pollution rate of micro-grafted seedlings and promote the elongation of adventitious roots. The response surface analysis further confirmed that the optimal experimental conditions for grape micro-grafting tissue culture were： HgCl2 disinfection time 7.1 min， light time 17 h， banana mud concentration 700 mg/L. On this basis， the survival rate of grape micro-grafted seedlings using the splicing method and tin foil as the binding material was significantly higher than other treatments.

Key words： grape; tissue culture; micrografting; response surface analysis

中國是葡萄（Vitis spp.）生产大国，截至2018年底葡萄产量已达845.0万t[1]。中国葡萄生产以鲜食葡萄为主，品种单一和苗木质量参差不齐是限制中国葡萄产业发展的主要原因，优质高效标准化栽培模式及管理技术对于葡萄现代化产业发展具有重要意义[2]。葡萄微嫁接技术是葡萄组织培养与嫁接繁殖技术的结合，具有周期短、效率高、不受季节限制和环境影响等优点[3]，自1972年Murashige等创立微芽嫁接技术以来，微嫁接技术已广泛应用于研究良种保存、植物检疫、砧穗亲和性、信号传导以及离体繁殖等领域[4]。因此，建立有效的鲜食葡萄微嫁接苗组培快繁体系是修复葡萄组织培养畸形发育及繁殖无毒苗木的基础。

常规的组培快繁体系包括外植体的接种、初代培养和继代培养等环节，微嫁接组培快繁体系在此基础上还涵盖微嫁接苗的建立及培养等技术。葡萄微嫁接苗的成活率受多种因素影响[5]，单独利用某种因素优化组培快繁体系较为片面。响应面（Box-Behnken design，BBD）法可在各环节单因素预试验条件包括最佳设计的前提下，通过对自变量和组培苗成活率的关系建立模型并进行综合分析，得到可靠的试验因素优化方案[6]。

本试验以鲜食葡萄品种晶红宝为试验材料，采用响应面法研究无菌外植体的消毒、组培光周期和培养基的成分及配比对葡萄微嫁接苗成活率的影响，结合适宜的微嫁接方法和最佳绑缚材料，建立并优化适用于葡萄微嫁接的组培快繁体系，为有关葡萄微嫁接的研究提供了良好的试验系统，同时也为鲜食葡萄良种保存和苗木繁育提供理论依据。

1  材料與方法

1.1   试验材料

于2017年7月在山西农业大学园艺站（37°25′21″ N，112°34′45″ E，803 m）采集晶红宝嫩梢作为优化葡萄微嫁接快繁体系的试验材料。试材采用篱架式种植，栽植密度为1.0 m×1.6 m，常规管理。

1.2  试验方法

1.2.1  外植体的消毒与培养  清晨露水未干时剪取健康的葡萄幼嫩茎段，流水冲洗2 h去除灰尘和虫卵，剪成约5 cm的茎段作为外植体，在超净工作台内进行表面消毒。具体消毒方法为：75%的乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗2～3次，0.1%的氯化汞浸泡后，无菌水冲洗5次。试验设计0.1%的氯化汞处理时间分别为6、8和10 min，处理后的茎段用灭菌的滤纸吸去表面水分备用。

将消毒后的材料截成约2 cm的单芽茎段，切去两端切口部位，接种于MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂培养基（pH 5.8～6.0）上，置于组培室培养。培养环境温度为（25±1） ℃，光照度为2 000 lx，光周期16 h/8 h（光/暗），10 d后观察记录葡萄组培苗的生长情况，并统计成活率、褐变率和污染率。

1.2.2  葡萄组培苗的微嫁接  葡萄外植体培养6周后剪取单芽茎段，采用3种不同方法进行微嫁接，7 d后观察统计成活率、褐变率及污染率。具体微嫁接方法如下。

1）劈接法。砧木切除芽节上的腋芽及叶片，上端纵切0.4 cm，接穗形态学基端纵切0.5 cm长的楔形，直接插入砧木的接口中，嫁接部位紧密不偏，包裹好接口处，接入培养基中。

2）圆孔接法。使用解剖针在砧木顶端切口扎深0.4 cm的圆孔，接穗基端削尖插入圆孔，接合紧密，接入培养基中。

3）“L”形接法。在砧木顶端向下纵切0.4 cm，截去一侧组织使顶端呈“L”形，接穗切成倒“L”形，将砧木和接穗的切口契合，接口包裹紧密，接入培养基中。

采用上述试验中最适宜的方法进行葡萄的微嫁接，选取锡箔纸、嫁接夹、Parafilm膜、吸管和铝片5种绑缚材料对微嫁接苗接口进行绑缚，7 d后观察统计成活率、褐变率及污染率。

1.2.3  MS培养基添加天然营养物质培养葡萄微嫁接苗  将葡萄微嫁接苗接种在添加500 mg/L不同天然营养物质（香蕉泥、枣泥、马铃薯泥、番茄泥、椰粉）的MS+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂培养基（pH 5.8～6.0）上，香蕉泥、枣泥、马铃薯泥与番茄泥均常温研磨，椰粉为常温冲泡，以不添加天然营养物质的培养基作空白对照。记录各处理下微嫁接苗的成活情况、生根情况和叶片数。

选取上述处理中微嫁接苗成活率最高的天然营养添加物，进一步设置浓度分别为250、500、750、1 000 mg/L的处理，观察统计微嫁接苗相关数据，探究培养基中添加该天然营养物质的最适浓度。

1.2.4  不同光周期环境培养葡萄微嫁接苗  设置不同的葡萄微嫁接苗培养光周期，分别为8 h/16 h、 14 h/10 h、16 h/8 h和24 h/0 h（光/暗），10 d后观察统计微嫁接苗的成活率、褐变率和污染率。

1.2.5  响应面法优化葡萄微嫁接组培快繁技术  在前期单因素试验结果的基础上，选取氯化汞消毒时间（A）、光照时间（B）和天然营养物质浓度（C）3个因素为响应曲面模型的自变量，每个自变量设置3个水平，分别编码为-1、0和1，以葡萄微嫁接苗的成活率为响应值进行响应面分析，试验方案设计见表1。

1.3  数据处理

试验采用单因素随机处理，设3组生物学重复。利用Excel 2013和SPSS 21.0软件进行数据处理与统计分析，Design-Expert 8.0.6软件设计分析响应曲面模型。

2  结果与分析

2.1  氯化汞消毒时间对葡萄微嫁接苗生长的影响

由表2可知，氯化汞消毒时间长短对葡萄组培苗的成活率、褐变率和污染率均有显著影响。经氯化汞处理8 min的葡萄微嫁接苗成活率显著高于其他2个处理，褐变率显著低于其他2个处理。长时间的氯化汞消毒可显著降低葡萄微嫁接苗的污染率，同时由于消毒剂对植物的影响，外植体褐变率显著升高。综合比较得出，氯化汞处理8 min消毒效果较好。

2.2  微嫁接方法对葡萄微嫁接苗生长的影响

不同微嫁接方法对葡萄微嫁接苗生长的影响差异显著（图1）。采用劈接法的葡萄微嫁接苗成活率显著高于“L”形接法和圆孔法，褐变率和污染率显著低于“L”形接法和圆孔法。因此，劈接法为葡萄微嫁接的最佳方法。

2.3  绑缚材料对葡萄微嫁接苗生长的影响

不同绑缚材料对葡萄微嫁接苗生长的影响如图2所示。使用锡箔纸作为绑缚材料的微嫁接苗成活率显著高于嫁接夹、Parafilm膜、吸管和铝片处理，而褐变率显著低于嫁接夹、吸管和铝片处理;使用吸管作为绑缚材料的微嫁接苗成活率显著低于其他处理（Parafilm膜除外），褐变率显著高于其他处理;使用Parafilm膜作绑缚材料则导致葡萄微嫁接苗的污染率显著增加。综上可见，锡箔纸是葡萄微嫁接的最佳绑缚材料。

2.4  天然营养物质对葡萄微嫁接苗生长的影响

在MS培养基中添加不同天然营养物质时，葡萄微嫁接苗的生长情况也存在显著差异（表3）。与不添加营养物质的培养基中微嫁接苗（空白对照）相比，添加香蕉泥可显著降低葡萄微嫁接苗的褐变率和污染率，提高平均根数和根长，但微嫁接苗成活率和叶片数无显著变化;添加枣泥可显著降低葡萄微嫁接苗的污染率，促進不定根的伸长;添加马铃薯泥培养的微嫁接苗成活率无显著变化，但褐变率和平均根长显著降低，污染率显著高于空白对照;添加番茄泥培养的微嫁接苗污染率显著高于空白对照，平均根长显著低于对照;添加椰粉后微嫁接苗的褐变率显著高于空白对照，其他指标无显著变化。结果表明，MS+香蕉泥最适用于葡萄微嫁接组织培养，可有效提高微嫁接苗成活率，促进植株生长。

进一步对添加香蕉泥的浓度进行探究得出，添加500和750 mg/L香蕉泥可显著提高葡萄微嫁接苗的成活率和不定根的数量及长度，而添加500 mg/L香蕉泥培养的微嫁接苗褐变率显著低于其他处理（表4）。因此，MS+500 mg/L香蕉泥为葡萄微嫁接组培快繁体系最佳培养基。

2.5  光周期对葡萄微嫁接苗生长的影响

不同光周期对葡萄微嫁接苗生长情况的影响存在显著差异（表5）。16 h/8 h光照时葡萄微嫁接苗成活率为50.5%，显著高于其他光周期处理，同时褐变率显著低于其他光周期处理。24 h/0 h光照环境显著降低了葡萄微嫁接苗的成活率，但污染率显著高于其他处理，其他处理的污染率之间差异不显著。因此，适度的暗处理对葡萄微嫁接苗的生长发育是十分必要的，16 h/8 h光照环境可保证较高的成活率，适用于葡萄微嫁接苗的组织培养。

2.6  响应面法优化葡萄微嫁接组培快繁体系

2.6.1  回归方程拟合与响应面分析  选择氯化汞消毒时间、光照时间和香蕉泥浓度作为响应面试验的自变量，按照三因素三水平的响应面试验设计方案，得出试验数据如表6所示。利用Design-Expert软件拟合试验结果得出响应面试验回归方程Y=62.60-9.82A+1.95B+8.23C-0.75AB+0.30AC+1.25BC-10.95A2-12.20B2-10.45C2。

由表7可知，模型的P值=0.000 1<0.01，表明模型与3个自变量的线性关系极显著，失拟项P值为0.301 0>0.05，且回归方程R2=0.970 9，表明该方程拟合良好，结果可靠。3个自变量对葡萄微嫁接苗成活率的影响排序为氯化汞消毒时间>香蕉泥浓度>光照时间。

如图3所示，表示不同试验因素间交互作用的等高线形状越接近椭圆形，因素之间的交互作用越显著，越接近圆形则交互作用显著性越低[7]。由图3可以看出，光照时间和香蕉泥浓度的交互作用明显，在三维立体图中出现最高值，且该值出现在较长的光照时间（16～20 h）和较高的香蕉泥浓度（500～750 mg/L）范围内。

2.6.2  模型最优试验条件的推断及验证  通过对响应面曲线和回归方程的分析，得到葡萄微嫁接苗成活率最高的试验条件为：氯化汞消毒时间7.11 min，光照时间16.92 h，香蕉泥浓度697.09 mg/L，在此条件下葡萄微嫁接苗成活率预测值为66.527 6%。

在最佳试验条件的基础上设置氯化汞消毒时间7.1 min，光照时间17 h，香蕉泥浓度700 mg/L进行验证试验，得到葡萄微嫁接苗的成活率为（65.2±0.8）%，与预测值无显著差异，证明响应面法可有效优化葡萄微嫁接组培快繁技术体系。

3  讨论

外植体的表面消毒是葡萄组培快繁的第一步，外植体消毒试剂种类较多，实际应用中常为追求更好的消毒效果而忽略消毒时间对外植体的影响，易造成消毒时间过长，毒害植物，降低外植体成活率[8，9]。氯化汞消毒耗时短，本试验采用0.1%的氯化汞溶液浸泡外植体，不仅对于降低葡萄外植体的污染效果显著，还可避免高浓度试剂的高毒性对试验人员造成伤害。

培养基的成分配比和培养环境对葡萄微嫁接苗增殖和生根影响显著[10，11]。方中明等[12]通过探究天然添加物对铁皮石斛类原球茎增殖、分化及生根的影响，确定香蕉汁和马铃薯汁均有利于铁皮石斛小苗生根。葡萄的组织培养中也常用天然营养物质为植株生长提供所需要的氨基酸和微量元素，促进侧芽萌发[13]，但具体种类与比例的选择尚无统一有效的方案。本试验中，接种于添加500 mg/L香蕉泥的MS培养基中的葡萄微嫁接苗成活情况显著优于其他处理，证明香蕉泥是葡萄组织培养的理想天然营养添加物。

微嫁接的具体操作是葡萄微嫁接组培快繁体系的重要环节[14]。目前常用的嫁接方法有劈接法、皮接法、“L”型接法和圆孔接法等，部分方法对接穗和砧木的茎粗有较高要求，操作困难且适用性有限[15];微嫁接苗砧穗接口的绑缚材料多选用移液枪头和硅胶管，这类材料操作便利，可以及时观察接口的愈合程度，Parafilm膜和嫁接夹成本高，且具有透光、导热和熔点低，难以高温灭菌等缺点，难以适应不同粗细微嫁接苗的绑缚要求，增加操作难度和污染风险[16]。本试验最终采用劈接法，并选用锡箔纸作绑缚材料，显著提高了葡萄微嫁接苗的成活率，进一步完善了葡萄微嫁接组培快繁技术体系。

响应面法是一种引入数理统计在内的试验设计优化方法，通过编码自变量水平设计响应面试验方案，并得出试验结果与所有自变量的回归方程[17]。响应面法建立的预测模型考虑到单个自变量影响的同时，还通过对模型适应性和显著性的检验分析，利用等高线图和3D图体现出自变量之间的交互作用[18]。本试验探究了外植体表面消毒时间、培养基天然营养添加物的种类和浓度及组培光周期对葡萄微嫁接苗成活情况的影响，采用响应面法进行分析，并结合微嫁接方法和绑缚材料的选择，得到葡萄微嫁接苗组织培养的最佳试验条件，建立了葡萄微嫁接组培快繁体系，为改善鲜食葡萄的苗木品质和繁育技术提供理论依据。

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收稿日期：2019-03-04

基金项目：山西省科技重点研发项目（201703D221014-4）;山西省青年拔尖人才计划项目（2018）;山西省高等学校优秀青年学术带头人项目（2017）;山西农业大学青年拔尖创新人才支持计划项目（TYIT201401）

作者简介：李雪雪（1994-），女，山西临汾人，在读硕士研究生，研究方向为葡萄微嫁接技术，（电话）18234498356（电子信箱）lishirley1994@163.com;通信作者，牛铁泉（1964-），男，副教授，硕士研究生导师，博士，主要从事葡萄栽培与种质资源创新研究，（电子信箱）niutiequan@126.com;纪  薇（1983-），女，副教授，硕士研究生导师，博士，主要从事葡萄栽培与种质资源创新研究，（电子信箱）jiweiputao@163.com。