EGFR、p53、Ki-67、AR在乳腺癌中的表达及预后意义

王小利 ，许德英，孙真真，白娇红，艾红伟，常永超

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的第二大原因[1]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因c-erbB1的表达产物，与细胞的生长、增殖和分化等过程密切相关，也是多种肿瘤的重要靶标分子。p53是一种编码核磷酸蛋白的重要抑癌基因，但其突变会导致癌变。ki-67是一种与细胞周期密切相关的核蛋白，可判断肿瘤的增殖情况，并在乳腺癌的临床预后中有重要意义[2]。雄激素受体(androgen receptor，AR)是类固醇激素受体家族中的一员，也是一种细胞内转录因子，对乳腺癌的诊治存在临床价值。目前乳腺癌的诊疗分子标志物有多种，但对联合检测乳腺癌的分子靶标评价报道还较少，且一般认为一期乳腺癌的5 a治愈率90%～95%，二期约70%～80%，三期约50%～60%，四期则低于10%，而临床中四期患者较少，所以作者随访时间均超过5 a。本研究主要通过免疫组化(immunohistochemistry，IHC)方法检测乳腺癌组织中EGFR、p53、ki-67及AR等分子标志物的表达，分析其与患者临床病理特征间的关系，并探讨其对乳腺癌患者的临床预后意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料组织芯片购于上海芯超生物科技公司，共145例样本，手术时间为2005年8月至2009年12月，随访至2015年7月，随访时间5.6～10 a，中位生存时间77(2～119)个月，术前均未接受乳腺相关治疗，病史资料完整，均为女性，中位年龄59.50(33～88)岁，HE染色验证其符合组织病理学特征。

1.2 主要试剂抗ER、PR、Her-2、EGFR、p53、Ki67及AR抗体均购自北京中杉金桥生物公司。

1.3 IHC方法操作步骤严格按照生物素—链霉卵白素免疫组化检测试剂盒(无锡傲锐东源)说明书进行，抗原修复采用高压修复法，阴性对照为PBS磷酸缓冲液代替一抗。

1.4 FISH方法按照荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridazation，FISH)检测试剂盒(广州安必平)进行操作，Her-2/CEP17比率大于2.2定义为HER2基因扩增。

1.5 结果判断评判标准参照许良中的评价标准[3]，随机观察不重复的高倍(×200)视野4～5个，计数100～200个肿瘤细胞；染色境界清晰、背景突出的棕黄色或棕褐色颗粒定义阳性细胞；根据阳性细胞数量及着色程度进行半定量分析。阳性细胞数量：阳性细胞<1%，计0分；1%≤阳性细胞数≤30%，计1分；31%≤阳性细胞数≤70%，计2分；71%≤阳性细胞数≤100%，计3 分；着色程度：0分为不着色；1分为浅棕色；2分为棕黄色；3分为棕揭色。两项分数累计相加：<3分为阴性(-)，≥3分为阳性(+)，分为两组进行分析；Ki67阳性定义为癌细胞核着色≥20%[4-5]；HER-2阳性为IHC染色强度≥5分和/或FISH检测HER-2基因扩增，阴性为IHC染色强度<3分和(或)FISH检测HER-2基因无扩增。

1.6 分型标准分子分型标准为2013年第十三届St.Gallen国际乳腺癌会议专家共识[4-5]，即：①Luminal A型：免疫组织化检测结果为ER阳性和/或PR阳性，Her-2阴性，Ki67<20%；②Luminal B型：ER阳性和/或PR阳性，Her-2阳性；或ER阳性和/或PR阳性，Her-2阴性，ki-67≥20%；③Her-2过表达型：ER、PR阴性，Her-2阳性，ki-67多为高表达；④Basical-like型：ER、PR阴性/Her-2阴性。本组研究对象145例乳腺癌，其中Luminal A型44例，Luminal B型32例，Her-2过表达型30例，Basical-like型38例。

1.7 统计学方法应用SPSS 19.0 及Graphpad Prism7.0软件进行统计学分析。采用Fisher 确切检验或χ2检验分析蛋白表达与临床病理特征之间的关系。Cox风险回归比例模型分析影响乳腺癌预后的独立危险因素。Kaplan-Meier 法计算生存曲线，单因素生存曲线采用Log-rank方法比较差异性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGFR、p53、ki-67及AR的表达IHC结果显示EGFR阳性表达定位于细胞核、细胞质及细胞膜，是一种分泌性蛋白；p53、ki-67及AR定位于细胞核，见图1。EGFR、p53、ki-67及AR在乳腺癌组织中的阳性表达分别为41.38%(60/145)、72.41%(105/145)、36.55%(53/145)及55.86%(81/145)，见表1。

2.2 EGFR、p53、ki-67及AR表达与临床病理特征的关系在145例乳腺癌组织中，EGFR、ki-67的表达与病理学分级及分子亚型间差异有统计学意义(P<0.05)，而与年龄大小、肿物大小以及淋巴结有无转移无统计学意义(P>0.05)；p53的表达则与年龄大小、肿物大小、淋巴结有无转移、病理学分级及分子分型分类间差异均无统计学意义(P>0.05)；AR的表达则除了与年龄大小间的差异无统计学意义(P>0.05)外，与其余4种临床病理特征间差异均有相关性，有统计学意义(P<0.05)，见表1。

D图为FISH法检测Her-2基因扩增(×1 000)，其余图均为IHC法检测(×200)。图1 ER、PR、Her-2、EGFR、p53、ki-67及AR阳性表达情况

2.3 EGFR、p53、ki-67及AR与乳腺癌的预后Cox多因素回归分析显示EGFR的差异性表达可作为影响乳腺癌患者的独立预后因素，差异有统计学意义(P<0.05，HR=1.55，95%Cl=1.02～2.36)，见表2。而K-M曲线显示EGFR、p53、ki-67及AR的差异性表达与肿瘤的累计生存率均无统计学意义(P>0.05)，见图2。

3 讨论

基因组研究分析发现，乳腺癌是一种异质性疾病。根据分子表型可将乳腺癌分为4类[4-5]，治疗措施也各不相同，故研究不同分子标志物在各类分子亚型乳腺癌中的表达意义非常重要，且Basical-like型乳腺癌与三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)约有80%的重合，而TNBC又具备局部复发率高、侵袭性强、远处转移早且预后差等特征。

表2 Cox风险比例模型分析影响乳腺癌患者独立预后因素

A:EGFR; B:p53; C:ki-67; D:AR。图2 K-M法计算EGFR、p53、ki-67、AR在乳腺癌中的累计生存率

EGFR是一种表皮生长因子受体，在多种肿瘤中常异常表达。该研究显示EGFR在乳腺癌中的总体阳性率为41.38%，在Her-2过表达和Basical-like型中的阳性表达率高达73.33%和78.95%，而在Luminal型乳腺癌中的表达率很低，提示EGFR对Her-2过表达和Basical-like型乳腺癌的发生发展可能起重要作用。且EGFR可作为乳腺癌预后的独立危险因素，这可能与EGFR异常表达的生物学特性，即促使癌细胞增殖、血管生成、转移、抑制凋亡等有关。所以EGFR表达水平或基因突变状态越来越多地被用于乳腺癌患者的靶向治疗。

p53是一种重要的抑癌基因。有研究表明，20%～35%的乳腺癌均存在p53基因突变，在TNBC中的突变率更高[6]。本研究显示在乳腺癌中p53的阳性表达率达72.41%，在Her-2过表达和Basical-like型中的阳性表达率高达73.33%和86.84%，但p53的差异性表达与乳腺癌的临床病理特征均不存在相关性，这可能是由于在大多数肿瘤中p53基因突变率较高但特异性较差的缘故，也有可能由于本次研究样本例数较少。

ki-67是一种与细胞增殖密切相关的核蛋白，也是Luminal B型乳腺癌分型的分子依据之一。本研究中ki-67的阳性表达率36.55%，在Luminal B型和Basical-like型中的表达率为69.70%和55.26%，差异有统计学意义，但与年龄、肿瘤大小和有无远处转移无相关性；但在TNBC中，有报道称ki-67高表达与肿瘤大小及淋巴结转移有显著相关性，而与年龄、临床分期无相关性，且提示Ki67可能是TNBC患者预后不良的一个指标[7-8]，由于本次TNBC样本数有限，并未做该方面的研究。

AR是雄激素受体，在本研究中阳性表达率为55.86%，与Chen C等[9]报道的阳性率基本一致，且肿瘤越大、病理学分级越高、有远处转移的乳腺癌患者AR的表达率越高。McGhan等[10]也发现AR阳性的TNBC与高病理学分级和淋巴结转移有关。在本研究中Luminal A型中的表达率最高达79.55%，而在Basical-like型中表达并不高，表明AR的高表达可能与ER和PR的高表达具有相关性。Millis等[11]评估了6 341例乳腺癌患者，结果显示TNBC中AR表达越高，ki-67水平越低，提示雄激素可能具有抗增殖作用。而本研究病例数有限，暂不能准确说明AR与ki-67表达的相关性。

本研究表明EGFR、p53、ki-67及AR的表达对乳腺癌患者的累计生存率并无统计学意义，可能是由于随访时间不够长，因为有研究表明EGFR和ki-67在单因素分析中对乳腺癌患者5 a无病生存率具有预测意义，而AR和p53没有[9]。有报道称ki-67表达与激素受体阴性的乳腺癌患者生存率无相关性，但对激素受体阳性的乳腺癌患者预后具有预测价值[12]。也有研究显示在TNBC中，p53基因突变率越高，患者的预后越差[13-14]。

总之，针对乳腺癌患者不单需要检测ER、PR和Her-2的表达状态，更应联合检测 EGFR、p53、ki-67和AR等分子标志物，这样有助于综合评价乳腺癌的发生发展进程，有效评估临床预后，为临床提供更佳治疗方案，也有助于患者的个体化治疗而实现精准医疗。