蒙古黄芪质量评价及商品规格等级研究进展

曹庆伟,张 瑞,李 科,李爱平,刘月涛,秦雪梅*

(1 山西大学中医药现代研究中心,太原 030006;2 山西大学化学化工学院;3 山西大学地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室;4 山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室;*通讯作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn;#共同通讯作者,E-mail:like@sxu.edu.cn)

中药作为我国传统医学与文化的瑰宝,是否能走向国际化,首先要解决的必然是安全性与有效性的问题,即中药材质量优劣问题。自古以来,中药材形成了“看货评级,分档议价”的市场规律。依据传统经验即“辨状论质”来判断中药材的好坏,逐渐形成了商品规格等级。但随着中药材栽培品大范围人工种植,且栽培药材在性状及品质上发生明显改变,导致现行的商品规格等级标准无法准确评价中药材质量优劣。本文以蒙古黄芪为例,总结黄芪药材优劣性评价方法及黄芪商品规格等级研究,修订黄芪商品规格等级标准,以期为黄芪质量等级标准的建立奠定基础。

1 蒙古黄芪药材质量优劣性评价研究进展

1.1 基于性状特征的评价

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根,前者主产东北,后者主产区在山西和内蒙、陕北等地。由于黄芪用量很大,加之野生资源的枯竭及再生能力的下降,我国北方多省均有人工引种。然而,传统使用的野生或仿野生(种子直播,根垂直生长)黄芪至少生长6年以上,且根深达1 m左右。20世纪80年代发展了平栽(育苗一年,第二年移栽,主根横卧于沟,生长一年即可上市)种植方式,其低成本生产特点,使黄芪产量迅速扩大,缓解了市场需求紧张。在性状特征评价方面,早在金元时期王好古[1]认为味甘如蜜,兼体骨柔软如绵的黄芪为最佳。以目前市场中存在的仿野生芪与移栽芪比较可以明显看出,仿野生芪具有“主根粗长、少分支、绵性大、粉性强、甜味足、豆腥味浓”等特点,而移栽芪外观与仿野生芪有较大差别,呈现“主根短、分支多、质坚硬、鸡爪型、微甜而淡”等特征。目前移栽芪虽然产量大,但品质不如仿野生芪。

1.2 基于化学成分的评价

1.2.1 黄芪药材多指标含量测定研究 中药疗效是多种化学成分协同作用的结果,多指标含量测定[2,3]符合中药多成分、多靶点等特征,因此已广泛应用于中药质量控制与评价,较准确反映了药材的差异性与均一性。

在黄芪多指标含量测定研究方面,胡方弟等[4]比较了黄芪与红芪中毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪甲苷含量,发现黄芪与红芪3种物质含量差异较大。Qi等[5]运用HPLC-DAD-ELSD法同时测定黄芪药材中6种黄酮与4种皂苷含量,更全面的对黄芪进行含量测定与质量控制。万燕晴[6]考察了不同商品规格等级黄芪药材黄酮与皂苷类10种成分含量差异,发现野生芪无论是黄酮类成分还是皂苷类成分都高于移栽芪。熊一峰[7]采用12种成分同时测定法评价黄芪药材质量,由于多数样品中未能检测到芒柄花素,故将芒柄花素含量排除在外后,以剩余11种指标含量为变量,最后得到84×11的数据矩阵。将数据导入到SPSS 19.0中进行变量之间的相关性分析,得到Pearson相关系数,以及各变量之间的相关显著性(见图1)[7]。其中,毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、紫檀烷苷和异黄烷苷为一类;毛蕊异黄酮、紫檀烷和异黄烷为一类;4种皂苷为一类。分别取名为黄酮苷类,黄烷类和皂苷类。对于黄酮苷类成分,4种成分存在明显的正相关,且毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量最高;对于黄烷类成分,3种成分含量较低,从检测灵敏度来讲不适用于含量测定;对于皂苷类成分,黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ可以通过碱化转化成黄芪皂苷Ⅳ,且4类皂苷正相关。黄芪多成分含量测定研究结果也证明了2015版《中国药典》黄芪项下选取毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷为含量测定指标的合理性。

图1 黄芪各指标成分相关分析[7]

1.2.2 黄芪甲苷含测方法研究 张宇等[8]运用正交设计的方法选择黄芪甲苷的最佳提取工艺,结果显示,加水量5倍,温度控制在40-60 ℃,超声提取30 min的工艺条件最好。王鹏等[9]采用正交试验筛选黄芪的最佳提取工艺条件,结果发现以甲醇 ∶氨水为9 ∶1,溶剂总量为150 ml,超声40 min提取工艺最好。丁如贤等[10]比较了4种不同黄芪甲苷的前处理方法,对是否过D101大孔吸附树脂及对回流提取与索氏提取效率进行了比较。实验结果表明,过D101大孔吸附树脂会对黄芪皂苷有一定的吸附量。省去大孔树脂吸附除杂这一步,对黄芪甲苷峰的分离及检测没有影响,可大幅提高黄芪甲苷浓度,提高了测定的准确性、稳定性和重现性。杜国军[11]建立了一种简便、省时的黄芪甲苷备样方法,即用甲醇超声提取时加入氨水处理前步骤,然后用不同浓度的乙醇过D101大孔树脂进行洗脱。

1.3 基于药效的评价

作为传统的补益名药,黄芪具有补气固表之功效。具有抗衰老、抗疲劳、抗病毒、抗癌、调节机体免疫、调节血糖、改善血液流变学、保护泌尿系统等药理作用[12],临床上常用于治疗冠心病心绞痛、心力衰竭[13]等。目前,以疲劳与心衰动物模型研究较多。

谢道生[14]比较了山西浑源野生黄芪与甘肃栽培芪补气与抗疲劳作用,结果显示,豆腥味浓的浑源黄芪在补气、抗疲劳(延长游泳力竭时间、减少血清尿素及血乳酸含量)、提高免疫器官指数以及总T淋巴细胞等方面作用明显高于栽培芪。何盼[15]采用大鼠负重力竭游泳模型研究黄芪抗疲劳作用,根据传统药效指标筛选出黄芪的最佳给药剂量、力竭时间,然后用筛选得到的最佳剂量,比较野生芪和移栽芪对大鼠的抗疲劳作用及代谢组学指标的干预作用,记录实验最后一天大鼠的力竭游泳时间,对血清生化指标进行分析。结果表明,野生芪和移栽芪均能延长疲劳大鼠的力竭游泳时间;改善组织病理学水平;与模型组相比,都可以对血清生化指标(CK、BUN、LDH、GLU),骨骼肌生化指标(SOD、MDA、GSH-Px)有回调作用,但是野生芪组大鼠的力竭游泳时间明显高于移栽芪,野生芪CK水平的回调效果也明显优于移栽芪。该研究结果表明野生芪对疲劳大鼠的干预作用显著优于移栽芪。高四云[16]采用“腹腔注射阿霉素致大鼠心衰”进行心衰实验造模,比较野生芪与移栽芪对心衰大鼠传统药效指标及代谢组学指标的干预作用。结果表明野生芪与移栽芪均能改善大鼠一般情况、组织病理学、心功能参数、血清生化指标及B型脑钠肽(BNP)水平;但与模型组相比,野生芪对心功能参数[射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)和左室收缩末期内径(LVIDs)]、生化指标肌酸激酶(CK)和血清BNP含量的干预作用优于移栽芪,且表现出显著差异。主成分分析结果显示,对照组和模型组的代谢轮廓明显区分,并鉴定了14个与心衰相关的潜在生物标志物,野生芪与移栽芪均能不同程度地回调其中14个标志物,2-羟基异丁酸、谷氨酸、丙酮酸盐、甲酸盐代谢物在野生芪组中变化率较大。该研究结果表明野生芪对心力衰竭大鼠的干预作用显著优于移栽芪,可为黄芪精细化商品等级规格标准的建立、临床合理用药和制药企业分类选择黄芪原料提供科学依据。

1.4 黄芪药材质量与生长年限相关性研究

孙思邈在《备急千金要方》中强调:“早则药势未成,晚则盛势已歇”,说明生长年限对中药材药理活性有较大影响。对于根类中药材,生长年限越长,次生代谢产物积累越多,药效才能越好。例如人参需要在长白山适宜的产地生长6年以上才可药用,其生长年限可通过地上部分和芦头形态得以判断,不同的生长年限可以区分不同的商品等级规格,市场交易时定价不同,以此保优淘劣。

对于仿野生芪而言,一般生长6年或6年以上采挖,部分供应市场的野生黄芪,其生长年限甚至长达几十年,不同的生长年限对化学成分的积累产生较大影响[17-21]。然而,目前在药材含量测定时很难明确样品的实际生长年限,主要原因是[7]:①主根不断向下生长,造成同一主根的上下段生长年限不同;产地加工时,按直径不同剪成不同的等级,上段较粗的根段生长年限较长,但目前的等级分类标准并未与确切的生长年限完全对应;②同一黄芪植株,侧根与主根的年限是否一致并不明确,产地初加工时,将侧根剪下与主根一起比较,依据直径的粗细被划分到不同等级中,也形成了药材同一等级生长年限混杂的现象。③同一地块,黄芪生长的第二年就能开花结实,种子从年老的植株落入土中又生长成新的植株,这样在同一地块中生长出来的黄芪根其实际年限并不一致,存在多个年限根的混杂。不同课题组测定不同商品规格等级黄芪药材毛蕊异黄酮葡萄糖苷与黄芪甲苷含量结果不一致是由于黄芪实际生长年限不确定。

2013年王军等[22]通过生长轮对黄芪进行年限鉴别,研究发现:山西浑源的黄芪根中具有清晰的生长轮(主要由次生木质部的大导管群形成),而且在生长年限较长的黄芪中发现,从上端到下端生长轮环数也不相同,其中上部的生长轮数多、下部的生长轮数少(见图2)。这说明对于黄芪药材来讲,多年生的根上部和下部的生物学年龄是不一致的,意味着上部和下部的次生代谢产物积累的程度也不同。因此黄芪商品规格等级以直径划分不全面,应结合黄芪实际生长年限划分黄芪药材等级。因此,高四云[23]通过徒手切片鉴定和石蜡切片验证方法,建立以生长轮数目为依据的黄芪根部年限鉴定方法,将黄芪药材绝对生长年限与直径关联,进而测定不同生长年限黄芪化学成分。结果发现山西仿野生芪特等主要为五年生以上;一等主要分布在4-5年;二等主要分布在3-4年;三等主要分布在2-3年;四等主要分布在1-2年。

熊一峰[7]对不同绝对生长年限黄芪化学成分含量进行比较,结果表明四年生总黄酮含量最高,两年生皂苷含量最高。研究为建立黄芪年限性状与规格等级关联奠定了基础。

A.黄芪完整的根;B.黄芪根中的空心;C.空心部分的组织结构;D.黄芪根上部的生长轮;E.黄芪根中开始产生空心图;F.开始产生的空心部分方法图;G.黄芪根中部的生长轮;H.黄芪根下部的生长轮;I.黄芪根的次生结构图2 山西浑源黄芪的生长轮解剖图[22]

2 黄芪药材商品规格等级标准研究进展

2.1 黄芪药材规格等级标准研究现状及存在问题

中药材商品规格等级的划分自古就有,中药材的质量在一定程度以规格等级体现“优质优价”。解放前,市场黄芪商品规格等级划分以《天津口岸黄芪出口标准》为主。新中国成立以来,国家先后3次颁布关于黄芪商品规格的标准,分别是1959年《38种药材商品规格标准》、1964年《54种药材商品规格标准》以及1984年国家中医药管理局与卫生部联合下达的《76种药材商品规格标准》。其中《76种药材商品规格标准》流通和应用最广泛。

本课题组[24]调查了不同企业与山西省地方标准黄芪商品规格等级的划分,对现行标准、各企业标准(见表1)进行整理汇总后发现:①各标准中黄芪均没有规格之分,仿野生芪与移栽芪性状差异无描述。②目前黄芪市场存在多个标准,各标准中虽然都是依据长度、直径进行等级划分,但是对直径的测量部位却有差异,各标准每个等级直径范围与长度范围也不相同。③仿野生芪为根部向下生长多年,2年生移栽芪为平地生长。两类黄芪长度差异较大,而各标准却无长度区分。④各个标准中对黄芪的等级划分数目不一致,由表1可知,不同标准黄芪等级等级划分数目为3-7个不等。

由此可以看出,众多标准的不一致导致黄芪商品交易过程的“同质不同价”和黄芪药材交易混论。分析其原因,由于缺乏对不同规格等级黄芪药材性状的深入调查研究,各类标准都不能完全涵盖市场中流通的各等级黄芪药材。为此,研究制订统一的黄芪药材商品规格等级标准是目前亟待解决的实际问题。

表1 黄芪规格等级划分

2.2 新修订的黄芪商品规格等级标准

2018年12月3日,中华中医药学会发布了团体标准《中药材商品规格等级-黄芪》(标准编号:T/CACM 1021.4-2018),针对以上标准存在问题,本课题组对黄芪标准作出了如下改进:①各个标准无黄芪规格之分,即对仿野生芪与甘肃移栽芪无性状区分。该标准根据仿野生芪与移栽芪性状差异,划分为两种规格(修订的黄芪药材规格差异见表2)。②针对黄芪多个标准直径测量部位不同,该标准统一了直径测量部位,即头部斩口下3.5 cm处(切掉芦头、二刀头及空心面积少于1/3处斩口下方3.5 cm处的直径)。选择此处原因为头部斩口下3.5 cm空心部分少于1/3,保证了黄芪品质。③针对各标准不同等级直径范围无统一定论,该标准确定了仿野生芪等级与绝对生长年限的关系(见图3),依据生长轮判定生长年限。不同生长年限黄芪化学成分差异较大,故仿野生芪等级划分应保持同一等级头部直径与末端直径绝对生长年限一致(修订的黄芪药材等级与直径差异见表2)。

A. 6年生黄芪生长轮;B. 5年生黄芪生长轮;C. 4年生黄芪生长轮;D. 3年生黄芪生长轮;E. 2年生黄芪生长轮;F. 1年生黄芪生长轮图3 同一条黄芪根不同直径处的生长轮数目[23]

2.3 黄芪质量与规格等级相关性研究

2.3.1 不同规格等级黄芪药材毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量比较 对于不同规格黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量,石子仪等[25]、姚雪莲等[26]和杜国军[11]考察了不同产地毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量,得出结果一致,山西仿野生芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量明显高于其他产地。对于不同等级研究,不同课题组所得结论不一致[6,27,28]。

2.3.2 不同规格等级黄芪药材黄芪甲苷含量比较 已有研究表明[7],黄芪甲苷主要存在于黄芪韧皮部,故直径越细,韧皮部占比越大,黄芪甲苷含量比例越高。不同实验室所得研究结果结论一致,然而当对不同产地黄芪含量比较时,不同实验室就会得出相互矛盾的结果。万燕晴[6]与牛倩芸等[27]比较了不同规格蒙古黄芪黄芪甲苷含量,结果显示仿野生芪含量显著高于移栽芪。王文全课题组[29]比较了不同商品等级野生芪与栽培芪黄芪甲苷含量,发现栽培芪含量高于野生芪。杜国军等[30]对比传统黄芪与栽培芪黄芪甲苷含量,结果显示二者无显著性差异。

表2 修订的黄芪药材规格等级划分

3 中药材商品规格等级标准到质量等级的演变

传统中药材商品规格等级的划分是对传统经验鉴别法的总结。它主要是从外观性状来评价。具有方法简便、重点突出、只通过直观鉴别就可以判断品质优劣。然而,已有研究表明,中药材传统商品规格等级划分与其质量的相关性不强,刘书斌等[31]对甘肃不同等级的党参进行化学含量测定,研究发现,白条党参二等品中有效成分党参炔苷含量高于一等和三等,这说明甘肃产地党参规格等级划分不合理。显然商品规格等级标准已无法满足评价中药材质量优劣的需求。

2018年7月20日,中国中药协会发布了行业内第一个“质量等级标准”-《西红花质量等级》标准(T/CATCM 002-2018)。这是第一个以“质量等级”区分药材“商品规格”的标准。判定该标准的中国食品药品检定研究院经过充分的文献调研、样品收集、实验研究、结果论证,在《中国药典》2015版西红花药材标准的基础上,增加西红花药材特征性成分苦番红花素作为质量指标,并以西红花苷Ⅰ及西红花苷Ⅱ的含量之和作为等级标准的划分依据,制定了《西红花质量等级》团体标准。它区别于传统以药材大小、粗细、重量作为“商品规格”区分的药材等级标准,较全面评价西红花质量。它不再局限于传统性状特征的描述,而是从更全面的化学有效成分与药效来评价药材质量,标志着中药材商品规格等级进入质量评价新时代。因此本文以蒙古黄芪为例,系统总结黄芪药材优劣性评价方法及黄芪商品规格等级研究,修订黄芪商品规格等级标准,希望通过黄芪外观性状与内在化学成分相关联,为后续黄芪质量等级标准的建立奠定基础。