莫莫格湿地石油污染土壤中耐盐碱石油烃降解细菌的降解特性研究

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(1.长春理工大学 生命科学技术学院，吉林 长春 130022；2.兴安盟农牧业科学院，内蒙古 乌兰浩特 137400；3.中国科学院 东北地理与农业生态研究所，吉林 长春 130102;4.科尔沁右翼前旗农牧业和科学技术局农业技术推广中心，内蒙古 科右前旗 137423)

0 引 言

在石油开采、贮运及使用过程中，操作不当会引起石油泄漏，对生态环境造成严重破坏，甚至威胁人类健康[1]。由石油所引起污染的问题已经越来越广泛被当今国际社会所关注。2011年6月，中国蓬莱19-3油田溢油事故造成海洋及土壤大面积污染，水体、土壤结构的破坏导致动植物生存受到威胁[2]；2017年1月，印度恩诺尔港口附近两艘油轮相撞，约392.8 t重质原油泄漏，破坏了海洋生态，并严重影响了海洋生物的生存[3]。中国作为世界第五大石油开采国，由石油所引起的污染问题亟待解决[4]。吉林省西部莫莫格湿地地下蕴藏着丰富的石油资源，该湿地内吉林油田英台采油厂所设立的400多口采油井在使用及操作过程中对湿地土壤造成了严重污染，致使优势植物苔草、小叶章大面积退化，栖息鸟类数量减少[5]。

当石油污染程度超过湿地生态系统的自我修复能力，那么缓慢的修复过程将再一次受到阻碍。在石油污染治理的探索过程中，Oh等[6]利用超声波法去除淤泥中的多环芳烃；于一雷等[7]利用植物原位修复的方法，通过种植碱蓬治理被石油污染的土壤；Tian等[8]利用凝胶珠与根系复合作用去除土壤中的多环芳烃。但物理修复与化学修复方法由于前期投入大、复合材料回收难等问题，在实际修复过程中难以应用。生物修复是利用生物自净功能与强化生物净化功能对污染场地中的污染物进行降解的过程，具有成本低，操作简便，不产生二次污染等优点[9-10]。国内外学者在菌株筛选上做了大量工作，许多细菌、真菌及藻类都有降解多环芳烃的能力[11]，常见的微生物有假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和微球菌属(Micrococcus)等[12-13]。莫莫格湿地石油污染区的土壤往往具有盐碱化特征，通常情况下环境因子(包括盐浓度、pH、温度及污染物浓度等)对微生物的代谢活动和生理功能影响较大，因此明确菌株对不同环境影响因子的响应是利用该菌株对石油烃污染进行生物修复的必要前提[14]。

本研究以石油中重要组分之一的多环芳烃—菲(Phenanthrene，Phe)为唯一碳源，辅以盐碱胁迫条件[15]，从莫莫格湿地石油污染土壤中筛选分离出一株在盐碱环境下对Phe具有降解能力的盐单胞菌(Holomonas)S1-8菌株，并对筛选的Holomonassp.S1-8菌株进行降解条件优化及降解能力测定，探讨其在盐碱胁迫下的降解动力学特征。结果表明菌株S1-8对盐碱环境具有良好的适应性，在生物修复被石油污染的盐碱土壤中具有潜在的应用前景。

1 材料与方法

1.1 研究区

本研究中土壤样本来源于吉林油田分公司英台采油厂，位于莫莫格国家自然保护区境内，地处嫩江、洮儿河和呼尔达河交叉地带。莫莫格国家级自然保护区(45°42′25″～46°18′0″N，123°27′0″～124°4′33″E)位于吉林省西部，总面积14.4万hm2，其中湿地面积占全区总面积的80%以上，莫莫格湿地是我国重要的候鸟繁殖地与跨国迁徙鸟类的停歇地，是我国主要的盐碱土地分布地之一。

1.2 采样点设置及样品采集

在莫莫格湿地内吉林油田主要产油区(该区为石油污染较为严重的区域)随机设置一个采样点(45°55′N，123°55′E)。在采样点，去除土壤表面杂物后采集0～20 cm深度土壤样本，将土样装入无菌密封袋内带回实验室。

1.3 实验试剂

试剂盒：Axygen细菌基因组DNA小量制备试剂盒、Axygen PCR试剂盒(康宁生命科学有限公司)和菲(分析纯AR，上海麦克林生化科技有限公司)。

磷酸盐缓冲液：pH 7.2、NaCl (8.0 g·L-1)、KCl (0.2 g·L-1)、Na2HPO4(3.4 g·L-1)和KH2PO4(0.2 g·L-1)。

LB培养基：NaCl(10.0 g·L-1)、胰蛋白胨(10.0 g·L-1)和酵母提取物(5.0 g·L-1)(Oxoid， Thermo Fisher Scientific)。

无机矿物盐培养基：Na2HPO4·12H2O (17.9 g·L-1)、NaH2PO4·2H2O (7.8 g·L-1)、(NH4)2SO4(5.0 g·L-1)、KCl (5.0 g·L-1)、ZnSO4·7H2O(0.1 g·L-1)、MnCl2·4H2O(0.03 g·L-1)、CoCl2·6H2O(0.2 g·L-1)、CuCl2·2H2O(0.01 g·L-1)、NiCl2·6H2O(0.02 g·L-1)、NaMoO4·2H2O(0.03 g·L-1)、FeSO4·7H2O(0.2 g·L-1)和H3BO3(0.3 g·L-1)(国药集团化学试剂有限公司)。

Agilent气相色谱(6890)-质谱(7000)联用仪。

1.4 实验方法

1.4.1 土壤理化性质。土样风干后过2 mm筛子备用。土壤pH用pH计法[16]；土壤Na+采用火焰光度法测定。

1.4.2 菌株的筛选。取10 g新鲜土壤样本，90 mL无菌生理盐水，置于灭菌三角瓶内，在摇床中30 ℃ 170 rpm震荡15 min后，静置，取1 mL上清液加入到20 mL以Phe为唯一碳源且含5% NaCl、pH 8.0的无机矿物培养基中，170 rpm，30 ℃培养7 d，筛选出能够降解Phe的耐盐碱菌株。

1.4.3 菌株鉴定及菌悬液制备。在LB固体培养基上稀释涂平板并划线与细菌扫描电镜样品的制备[17]。

1.4.4 菌株分子生物学鉴定。PCR扩增菲降解菌株16S rRNA基因及其PCR产物测序分析。菲降解菌株DNA扩增通用引物为p27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和p1492r (5′-ACGGHTACCTTGTTTACGA-CTT-3′)，在包含2 μL 2×Eassy Taq PCR SuperMix (TransGen Biotech 2×Easy Taq PCR SuperMix，CA)、2 μL PCR引物(27F and 1492R)及1 μL DNA 模板的50 μL PCR反应体系中，采用细菌PCR反应条件进行扩增(预变性：94 ℃下5 min；该扩增程序进行30次循环：变性94 ℃下45 s，退火55 ℃下45 s，延伸72 ℃下60 s；最终延伸：72 ℃下10 min，4 ℃下保温，终止流程)，进行PCR扩增。将纯化后的PCR产物使用Sanger测序法进行双端测序(上海生工生物技术有限公司)。测序结果与GenBank中已有的16S rRNA基因序列进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比对。

1.4.5 不同培养条件下菌株对Phe的降解效率研究。下列所有实验中菌悬液的制备按照此标准：在无菌条件下将筛选得到的菌株接种到LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体，并用无菌生理盐水反复洗涤3次，经无机矿物盐培养基重悬后，将菌悬液调至所需浓度备用。

不同取样时间和盐浓度条件下菲降解菌株对Phe的降解效率及其降解动力学研究。由于筛选菌株的土样Na+含量较高，本研究中设置7个不同盐浓度(0、2%、5%、10%、15%、20%和30%的NaCl)培养条件，研究菲降解菌对Phe的降解能力。按5%的接种量接种到20 mL初始添加浓度为50 mg·L-1Phe的无机矿物盐培养基中，使培养基中菌液初始添加浓度OD600为0.2，分别在不同盐浓度条件下30 ℃震荡培养15 d；在培养1 d、3 d、5 d、7 d、10 d和15 d时，检测不同培养时间下培养液中Phe的残留量，最终计算出菲降解菌在不同培养时间对Phe的降解率；根据Phe降解率研究其在不同盐浓度条件下的降解动力学。本研究中降解实验均设立3组平行。

不同pH条件下菲降解菌对Phe的降解效率。利用HCl或NaOH调节最适生长的盐浓度培养液的pH，在6个不同pH梯度(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0)且Phe的初始添加浓度为50 mg·L-1的无机矿物盐培养基中接入菌液，使细菌初始添加浓度OD600为0.2，30 ℃震荡培养15 d，研究菲降解菌在不同pH条件下对Phe的降解能力。

不同温度条件下菲降解菌对Phe的降解效率。在最适生长的盐浓度和pH的无机矿物盐培养液中接入菌液，使培养基中细菌初始添加浓度OD600为0.2，在5个不同温度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃)且Phe的初始添加浓度为50 mg·L-1条件下，震荡培养15 d，研究菲降解菌在不同培养温度条件下对Phe的降解能力。

不同Phe初始浓度条件下菲降解菌对Phe的降解效率。确定最适生长的盐浓度、pH和温度的条件下，在5个不同Phe初始添加浓度(25、50、100、150和200 mg·L-1)的无机矿物盐培养液中接入菌液，使培养基中菌液初始添加终浓度OD600为0.2，30 ℃震荡培养15 d，研究菲降解菌在Phe不同初始添加浓度条件下对Phe的降解能力。

1.4.6 溶液中Phe的提取与定量分析。残留Phe的提取。将培养基全部转入分液漏斗后，用10 mL正己烷分3次清洗三角瓶并将正己烷全部转至分液漏斗中，将分液漏斗置于分液漏斗振荡器上，270 rpm充分震荡10 min，静置，将培养基中剩余Phe萃取至有机相中，收集有机相。取有机相溶液过0.22 μm尼龙滤膜，将滤液用色谱纯正己烷稀释10倍，待测。

GC-MS检测。配制Phe浓度分别为1 mg·L-1、3 mg·L-1、5 mg·L-1、7 mg·L-1、10 mg·L-1和15 mg·L-1的正己烷标准样品，利用Agilent气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，设置样品检测条件后进行实际样品的检测，根据标准样品的浓度与积分峰面积制作标准曲线[18]。

在动力学的研究中，生物降解的过程是单反应物反应体系，故选择一级动力学模型进行降解动力学的研究[19]。研究表明，微生物降解动力学可以用Logistic模型、零级及一级反应模型等多种模型来描述，当污染物初始浓度较高时，一级反应模型能够较好的模拟微生物降解动力学过程[20]。在Phe作为唯一碳源的无机矿物盐培养基中，菲降解菌生长过程中对NaCl浓度的敏感影响着一系列的反应，本研究采用Langmuir-Hinshelwoood模型来描述在不同盐浓度条件下S1-8降解Phe的动力学。一级动力学方程为：

lnC=-kt+lnC0

式中：k表示一级动力学速率常数(d-1)；C为t(d)时刻Phe浓度(mg·L-1)；C0为初始Phe浓度(mg·L-1)。

1.4.7 数据统计分析。将16S rRNA基因序列比对结果，用MEGA 6.0软件构建菲降解菌株系统发育树。用Microsoft Excel 2010版绘制标准曲线，并计算Phe降解率。用Origin 8.0软件绘制Phe降解率曲线并研究Phe降解动力学模型。

2 结果与讨论

2.1 耐盐碱Phe降解菌株的分离、筛选与鉴定结果

本研究采集土壤样本的pH为8.51，Na+含量为21.3 g·kg-1。利用Phe为唯一碳源，辅以盐碱胁迫对土壤样品中的微生物进行富集培养，并对富集的微生物进行分离和纯化，最终筛选到一株耐盐碱的菲降解细菌，命名为S1-8。图1为菌株S1-8在LB固体培养基上的菌落形态(图1a)及扫描电镜照片(图1b)。结果表明：菌落形态为圆形，表面光滑且边缘整齐，微微凸起(图1a)；细菌呈杆状且表面光滑(图1b)。

图1 盐单胞菌S1-8在LB培养基上的菌落形态图(a)和扫描电镜图片(b)Fig.1 Morphological properties of Halomonas sp.S1-8 by the observation of LB agar plate (a) and scanning electron microscopy(b)

经PCR扩增获得菌株S1-8 16S rRNA基因片段，约为1 500 bp。将获得的序列在NCBI网站上进行BLAST比对，结果显示S1-8与Halomonasvariabilis(HTG7AY204638.1)的相似度最高(99%)，表明该菌为Halomonas菌属。选取12株Halomonas代表菌株作为参考菌株，采用邻接法构建S1-8的系统发育树(图2)，结合细菌形态并分析其系统发育树，明确该菌株属于盐单胞菌属(Halomonas)，故将其命名为Halomonassp.S1-8 (NCBI注册号为MK326897)。

图2 利用邻接法构建菌株S1-8的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the S1-8 strain constructed by Neighbor-joining method

2.2 菌株培养条件优化及降解能力测定

2.2.1 盐浓度对菌株S1-8降解Phe效率的影响。如图3所示，S1-8在Phe降解过程中，NaCl浓度显著影响其对Phe的降解过程。当NaCl浓度低于5%时， Phe的降解率与盐浓度呈正相关关系，随着盐度的升高，各个时期Phe的降解速率增加，降解率增大，同时结果表明在盐浓度为5%的条件下培养15 d后，Phe的降解率最高，达到74%；当盐浓度高于5%，随着盐浓度由10%增加至30%，S1-8各个时期的降解率明显下降，菌株的降解效果随着盐度的增加受到了明显的抑制，在盐度为30%条件下，Phe的降解率降低至41%。该实验结果表明，菌株S1-8对盐浓度具有较广的适应范围，并在试验盐浓度条件下均可有效发挥其对Phe的降解功能，但降解能力受盐度高低的影响。周海燕[21]在研究中发现，嗜盐菌株TSL5-1、TSL5-2耐盐范围较广，在0.5%～19.5%盐度范围内均对芘具有降解能力，但其最适降解盐度仅为3%～5%，且微生物在生长过程中，通常对盐的耐受性不高，盐浓度较低时，微生物生长速率与盐浓度呈正相关关系，但当盐浓度超过一定限度，微生物生长则变得较为缓慢，甚至死亡。苗朝华[22]在研究中发现对盐度适应范围较广的中度嗜盐菌黄河盐单胞菌，能够在盐含量为0.5%～25%的LB培养基中生长，并对其复杂的盐适应机制进行探究。张海荣等[23]在石油污染盐碱土壤中筛选得到10株耐盐碱石油烃降解菌，菌株对盐浓度的耐受浓度均在5%左右，当盐浓度高于11%时菌株的生长活性呈下降趋势，因此过高的盐浓度对菌株的生长具有一定的抑制作用。在盐单胞菌的研究中，研究者们发现该种属细菌的不同菌株对盐浓度具有较广的适应范围，在适宜的盐度范围内，盐度对其生理代谢功能影响较小，超过最适盐度，其生理活性会随着盐度的增加而降低。

2.2.2 pH对菌株S1-8降解Phe效率的影响。pH是微生物生长代谢的主要影响因素之一，环境pH对微生物的生物活性有很大的影响，同时微生物对pH适应范围广，在一定程度上说明微生物对环境适应能力更强[24]。因此，研究菌株最适生长的pH在微生物生长代谢中至关重要。李丹丹等[25]在莫莫格石油污染土壤中分离出的假单胞菌，在偏酸性pH 6.5时对石油烃降解率最高。从图4中可以看出，S1-8 在无机矿物盐培养基的pH为6.0～11.0时均具有对Phe的降解能力。pH为6.0时，培养15 d后Phe的降解率达到55%，随着pH增加，菌株S1-8对Phe的降解率也在增加，直至pH达到8.0时，菌株15 d内对Phe的降解率达到峰值，约为74%。随着pH的继续提高， S1-8对Phe的降解能力显著下降，但当pH达到10.0以上时，pH对菌株降解Phe能力的影响差异不显著。上述结果说明菌株S1-8具有较强的环境适应能力且在弱碱性环境中可获得对Phe的最高降解率，但在弱酸和强碱环境中S1-8对Phe的降解率相对较低。

注：温度:30 ℃；Phe初始浓度:50 mg·L-1；pH 8.0；菌液初始添加OD600=0.2。Note:Temperature: 30 ℃;Initial concentrations of Phe:50 mg·L-1;pH 8.0;OD600=0.2.图3 S1-8在不同盐浓度下各时间点对Phe的降解效率Fig.3 Degradation efficiency of S1-8 for Phe at different incubation time under different salt concentrations

注：温度：30 ℃；Phe初始浓度：50 mg·L-1；盐浓度：5%；菌液初始添加OD600=0.2。Note:Temperature: 30 ℃;Initial concentrations of Phe:50 mg·L-1;Salt concentration: 5%;OD600=0.2.图4 S1-8在不同pH条件下培养15 d后对Phe的降解效率Fig.4 Degradation efficiency of S1-8 for Phe after incubation for 15 days under different pH

2.2.3 温度对菌株S1-8降解Phe效率的影响。温度也是影响微生物活性的重要因素之一，Phe的降解效果间接地受到了温度的影响[26]。本研究中，S1-8菌株在盐浓度为5%，pH为8.0的条件下，选择15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃这5个温度条件培养15 d后，结果如图5所示，S1-8能够在温度为15 ℃～35 ℃环境中生长，尤其是在30 ℃培养条件下，Phe最终降解率约为74%；该菌株在常温条件下筛选分离获得，在15 ℃和20 ℃时，由于培养温度较低，菌株的降解能力并不突出，可能该菌株对低温较为敏感，对降解率的影响较大；当在25 ℃和35 ℃温度条件下培养15 d，降解效率分别达到51%和48%，说明在25 ℃～35 ℃为菌株适宜生长的温度区间，在该温度区间下S1-8对Phe的降解能力较高。

注： Phe初始浓度：50 mg·L-1；pH 8.0；盐浓度：5%；菌液初始添加OD600=0.2。Note:Initial concentrations of Phe: 50 mg·L-1;pH 8.0; Salt concentration: 5%; OD600=0.2.图5 S1-8在不同温度下培养15 d对Phe的降解效率Fig.5 Degradation efficiency of S1-8 for Phe after incubation for 15 days under different temperature

2.2.4 Phe初始浓度对菌株S1-8降解Phe效率的影响。不同Phe初始浓度对微生物降解Phe的效率影响很大。当Phe初始浓度较低时，有利于微生物对多环芳烃的降解；而当Phe初始浓度较高时，微生物对多环芳烃的降解能力降低，高浓度的Phe使细胞代谢受到抑制，对微生物的生长产生抑制作用，从而降低了微生物对Phe的降解能力。当Phe初始添加量为25 mg·L-1、50 mg·L-1时，由于低浓度的Phe对菌株无明显的抑制效果，菌株可以较好地发挥降解功能，其降解效率较高。随着Phe初始添加量增加至100 mg·L-1，Phe对菌株的胁迫增强，Phe的降解率呈现下降趋势；当Phe初始浓度增加至150～200 mg·L-1时，高浓度的Phe对菌体抑制更加严重，降解率进一步降低。随着Phe初始浓度的提高其降解率由最高74%降至7%。这和宋立超[27]的研究结果具有一致性，即在Phe初始浓度达到75 mg·L-1时降解率急剧下降。由此可见，底物浓度过高会对微生物降解Phe产生阻碍作用。一方面，由于Phe具有较强的疏水作用，高浓度Phe不利于微生物对溶解氧的获取，影响微生物对Phe的代谢作用；另一面，高浓度Phe及其中间代谢产物可能会对微生物可产生一定的毒害作用。因此，尽管菌株S1-8对Phe具有一定的浓度耐受性，但其耐受程度是有限的，而事实上，除了Phe泄露区或石油泄漏核心区，很少有环境中有极高浓度的Phe存在，因此，大多数的菲降解菌仍可发挥其功能。

2.3 不同盐浓度条件下菌株S1-8的降解动力学

在pH 8.0的碱性环境中，辅以不同盐浓度胁迫，菌株S1-8对Phe的降解拟合线性图如图7所示，由图可看到拟合的一级降解模型较好，可以很好地反映菌株在不同盐浓度条件下的降解能力。由表1拟合参数可知，在20%、30%高盐浓度条件下，由于微生物对Phe的利用受到抑制，使S1-8对Phe的降解率显著降低，在这两个盐浓度条件下R2较低；其余5个盐浓度条件下的R2均在0.92之上，说明该方程可较好地拟合菌株S1-8在不同盐浓度条件下的对Phe的降解过程，为菌株S1-8生物降解Phe的工程化应用等方面的研究起到重要的指导作用。

注：温度：30 ℃；盐浓度：5%；pH 8.0；菌液初始添加OD600=0.2。Note: Temperature: 30 ℃; Salt concentration: 5%;pH 8.0; OD600=0.2.图6 S1-8在不同Phe初始浓度条件下培养15 d对Phe的降解效率Fig.6 Degradation efficiency of S1-8 for Phe after incubation for 15 days under different initial concentrations of Phe

图7 菌株S1-8降解Phe的准一级动力学拟合曲线Fig.7 Curves of the first-order kinetics of Phe biodegradation by strain S1-8

盐浓度NaCl/%判断系数Adj.R-Square速率常数k标准误差SE残差平方和Residual sun of squares标准均方误差SD00.950 70.062 20.005 80.028 00.005 620.968 10.086 40.006 40.034 40.006 950.983 70.091 80.004 80.019 50.003 9100.986 00.045 70.002 20.004 20.000 8150.920 20.046 80.005 60.026 30.005 3200.784 50.039 70.008 30.058 10.011 6300.826 80.039 20.007 20.043 70.008 7

3 结 论

本研究中耐盐碱Phe降解菌筛选分离自莫莫格湿地被石油污染的土壤，确定该石油烃降解菌为盐单胞菌，将其命名为Halomonassp.S1-8。菌株S1-8对盐浓度及环境酸碱度具有较广的适应范围，分别为盐度0～30%和pH 6.0～11.0。在初始盐浓度为5% ，pH为8.0，培养温度为30℃条件下，菌株S1-8对Phe的降解达到较为理想的效果，且该降解过程符合一级动力学模型。菌株S1-8最适生长的盐浓度及酸碱环境均接近于莫莫格湿地石油污染土壤的化学指标，将该地区土壤中筛选分离获得的土著菌株应用于石油污染土壤的原位修复，亦能够更好地发挥菌株对石油污染物的降解特性。Halomonassp.S1-8是一株性能优良的可用于莫莫格湿地石油污染土壤修复的土著菌株。