急性冠状动脉综合征患者外周血β2整合素和Fractalkine的表达水平及机制研究

朱锐，吴校林，周青，李彬，李宸宇

（襄阳市中心医院 心血管内科，湖北 襄阳 441021）

急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）主要是不稳定的冠状动脉粥样硬化斑块发生破裂，并伴发炎症激活、血小板聚集及血栓形成导致血管完全或不完全闭塞而引起心肌缺血坏死的临床综合征[1]。斑块和血液中的淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞等炎症细胞及其分泌的炎症因子密切影响着动脉粥样硬化和ACS 的发生、发展[2]。Fractalkine 作为一种常见的炎症趋化因子，可与白细胞表面的受体结合，触发β2 整合素和黏附分子的表达和活化，参与动脉粥样硬化的炎症反应过程[3]。因此，笔者对ACS 患者血液中的Fractalkine、β2 整合素[（淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1）、CD11a/CD18 巨噬细胞分子1（CD11b/CD18,Mac-1）]、细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）等指标进行检测并探讨其作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月—2017年10月襄阳市中心医院收治的86 例ACS 患者。其中，不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris,UA）32 例（UA 组），急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）54 例（AMI组），同时选取20 例冠状动脉造影正常患者（正常组）和28例稳定型心绞痛（stable angina pectoris,SAP）患者（SAP 组）作为对照。纳入标准：所有患者均行冠状动脉造影检查且诊断均符合临床诊断标准。排除标准：感染性疾病、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、自身免疫性疾病、肿瘤及严重心肾功能不全。4 组患者年龄、性别、危险因素及服药情况等具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞术 采用流式细胞术检测β2 整合素LFA-1（CD11a/CD18） 和Mac-1（CD11b/CD18）的表达。所有患者于入院后第2 天清晨空腹采肘静脉血2 ml 置于含乙二胺四乙酸抗凝的采血管中，混匀后取100μl 全血加入10μl 异硫氢酸荧光素标记的鼠抗人CD11a 抗体（美国BD 公司）和10μl 藻红蛋白（phycoerythrin,PE）标记的鼠抗人CD18 抗体（美国BD 公司）置于A 管中；100μl 全血加入10μl FITC标记的鼠抗人CD11b 抗体（美国BD 公司）和10μl PE 标记的鼠抗人CD18 抗体置于B 管中；C 管中加入100μl 全血和阴性对照抗体（美国BD 公司）。室温孵育30 min，每管中加入1 ml 红细胞裂解液混匀后避光反应10 min，2 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入1 ml 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution,PBS）洗涤2 次，沉淀的白细胞加入0.5 ml PBS 缓冲液后上机检测。采用FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD 公司）检测10 000 个细胞，Cell Quest 软件分析，结果以阳性细胞百分率表示。

1.2.2 血清Fractalkine 和ICAM-1 的检测 抽取空腹静脉血2 ml 置于无任何添加剂的采血管中，2 h 内以2 000 r/min 离心10 min，取上层血清于环氧树脂管中并保存在-70℃冰箱中备用。血清中Fractalkine 和ICAM-1 的水平采用酶联免疫吸附法测定，酶标仪为瑞士Tecan 公司产品，操作步骤严格按照试剂盒（美国Elabscience 公司）说明书进行并绘制标准曲线。

1.2.3 Western blotting 检测 1 ml 静脉血加入5 ml红细胞裂解液混匀后避光反应10 min，2 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入5 ml PBS 缓冲液洗涤2 次；再向沉淀的白细胞中加入1.5 ml 总蛋白提取液4℃下14 000 r/min 离心30 min，取上清保存备用。取20μg蛋白样品，SDS-PAGE 电泳，100 V 转移约1 h，溴酚蓝到达分离胶的底端处附近即可停止电泳。再将蛋白电泳转移至聚偏氟乙烯膜上，放入封闭液中37℃封闭1 h；加入武汉博士德公司的抗黏着斑激酶 （focal adhesion kinase,FAK）抗体（1：500）和抗蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）抗体（1：500），4℃过夜，反复洗膜后，将膜与相应的二抗孵育，室温下轻摇1 h，洗膜后放入显影液显影，定影液定影，将胶片扫描得到照片。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较

4 组患者临床资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4 组患者住院期间均服用他汀类药物和双抗血小板药物（阿司匹林加氯吡格雷或替格瑞洛）。见表1。

表1 4 组患者临床资料比较

2.2 LFA-1、Mac-1 水平比较

4 组患者外周血白细胞中LFA-1（CD11a/CD18）、Mac-1（CD11b/CD18）阳性细胞百分率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；AMI 组和UA组患者LFA-1、Mac-1 阳性细胞百分率高于SAP 组和正常组患者（P＜0.05），且AMI 组患者LFA-1 和Mac-1 阳性细胞百分率较UA 组患者更高（P＜0.05）。见表2。

表2 4 组患者LFA-1、Mac-1 水平比较 %

2.3 血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比较

4 组患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；与SAP组患者相比，AMI 组和UA 组患者较SAP 组患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平升高（P＜0.05），且AMI组患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平较其他3 组高（P＜0.05）。见表3。

2.4 外周血白细胞FAK、PKB 蛋白水平比较

正常组、SAP 组、UA 组及AMI 组患者外周血白细胞FAK 蛋白相对表达水平分别为（0.545±0.027）、（0.659±0.039）、（0.783±0.039）及（0.942±0.079），4 组患者外周血白细胞FAK 蛋白水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=12.497，P=0.002）；UA 组和AMI 组患者FAK 蛋白水平高于SAP 组患者（P＜0.05）。正常组、SAP 组、UA 组、AMI 组患者外周血白细胞PKB 蛋白相对表达水平分别为（0.584±0.011）、（0.620±0.016）、（0.758±0.030）及（0.853±0.044）。4 组患者外周血白细胞PKB 蛋白水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=19.431，P=0.000）；UA 组和AMI 组患者PKB 蛋白水平高于SAP 患者（P＜0.05）。正常组和SAP 组患者FAK 和PKB 蛋白水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、2。

表3 4 组患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比较 （±s）

表3 4 组患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平比较 （±s）

组别 n Fractalkine/（ng/L） ICAM-1/（ng/ml）正常组 20 442.7±32.1 157.9±37.8 SAP 组 28 571.6±37.7 359.9±45.2 UA 组 32 683.4±49.6 438.34±48.6 AMI 组 54 873.1±55.4 530.3±60.1 F 值 83.334 53.072 P 值 0.000 0.000

图1 4 组患者外周血白细胞FAK、PKB 蛋白的表达

图2 4 组患者外周血白细胞FAK、PKB 蛋白水平比较 （±s）

3 讨论

动脉粥样硬化是一种血管慢性炎症反应性疾病。ACS 是动脉粥样硬化的主要临床表现，包括ST 段抬高型心肌梗死、非ST 段抬高型心肌梗死及UA[4]。ACS 通常是易损的粥样硬化斑块破裂或不稳定引起相关的冠状动脉部分或完全闭塞。易损斑块中含有大量的炎症细胞，斑块破裂后将引起血管中的白细胞聚集、黏附、游走、侵蚀。炎症细胞激活，合成和释放趋化因子、生长因子等炎症细胞因子，放大炎症反应，并促进白细胞β2 整合素与黏附分子结合、血小板聚集、血栓形成及血管平滑肌细胞增殖，导致血管狭窄或闭塞[2，4-5]。因此，冠状动脉局部或全身的炎症反应在急性心肌缺血事件中起着重要的作用。

整合素是一类广泛存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，是细胞外基质环境和细胞内信号传导的纽带。其主要介导细胞与细胞外基质、细胞和细胞之间的黏附，细胞迁移，参与止血、血管生成及胚胎形成等生理过程[6-7]。其中β2 整合素只表达于白细胞，也称之白细胞整合素，在炎症反应中具有重要作用。LFA-1（CD11a/CD18） 和Mac-1（CD11b/CD18） 是β2 整合素的两个重要成员，其可与配体ICAM-1 结合，调节白细胞稳定黏附到血管内皮细胞上，为白细胞穿越血管内皮提供条件，便于白细胞游走到炎症部位并发挥致炎作用[8]。Fractalkine 也称为CX3CL1，是趋化因子CX3C 亚家族的唯一成员，其受体CX3CR1 主要表达在T 淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞上，介导Fractalkine 的趋化作用[3]。研究发现，Fractalkine/CX3CR1 信号通路参与动脉粥样硬化的炎症反应过程，主要起促炎症反应的作用[9]。Fractalkine 不仅可介导白细胞黏附和跨膜转移过程促进循环中白细胞游出；还诱导IFN-γ、TNF-α 表达，损伤内皮细胞，促使巨噬细胞释放基质金属蛋白酶降解粥样硬化斑块纤维组织中胶原蛋白，导致纤维帽变薄，斑块出现溃疡或破裂，诱发ACS[3，9]。笔者研究发现，ACS 患者血清中Fractalkine、ICAM-1 水平和外周血白细胞中LFA-1、Mac-1 阳性细胞百分率高于冠状动脉造影正常和稳定型冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）患者，提示Fractalkine、ICAM-1、LFA-1 及Mac-1 参与ACS 局部和全身的炎症反应并且相互作用，且AMI 时这些炎症指标最高，炎症反应最强，这与国外的研究结果一致。

既往研究发现，当整合素与ICAM-1 等配体结合后，FAK 构象改变，使Tyr397 自身磷酸化，Tyr397通过结合磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K）的p85 亚基SH2 结构域激活PI3K途径。PKB为PI3K的下游信号，参与白细胞活化、心肌缺血再灌注、细胞增殖及凋亡等很多重要的生理过程[10-11]。笔者通过Western blotting 技术检测外周血白细胞FAK、PKB 蛋白表达水平，结果发现ACS 患者FAK、PKB 蛋白水平较冠状动脉造影正常和稳定型冠心病患者升高。这一系列研究结果表明，ACS 时外周循环中β2 整合素、FRACTALKINE 等趋化因子及黏附分子表达增加、水平增高，增加的Fractalkine与白细胞表面的受体结合后促进β2 整合素LFA-1、Mac-1 及黏附分子ICAM-1 活化，激活FAK-PI3K/PKB 信号通路参与ACS 的炎症反应。

综上所述，随着笔者对不稳定粥样硬化斑块和ACS 炎症反应机制的进一步认识，有助于寻找ACS 新的治疗靶点，为ACS 的防治提供新的方向。