龙胆苦苷对大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响

董圣军，李欣，高天勤，刘宝辉，程春雷，吴恩刚，王玉玖

(1.滨州医学院附属医院，山东 滨州 256603；2.滨州市人民医院，山东 滨州 255610；3.山东省食品药品检验研究院，山东 济南250101)

主动脉夹层(Aortic dissection，AD)是一种非常凶险的疾病，具有起病急骤、临床表现复杂多样、死亡率高，预后差的特点[1]。 文献报道，其年发病率约2.9/10万，已成为严重威胁国人生命健康的重要疾病[2]。在AD发病过程中，主动脉中层变性尤其是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)密度与分布的改变是重要的病理特征[3]。因此，抑制VSMC增殖、迁移及表象转换是降低血管疾病发生发展的方法之一。近年来，传统中药因来源广泛、副作用少、病人安全应用历史长及缺乏耐药性等优点越来越到关注。龙胆苦苷(Gentiopicro-side，GPS)是龙胆科龙胆属植物龙胆的主要有效成分，大量的临床及实验研究发现，GPS不仅有抗炎止痛[4]、保肝利胆[5]、抗氧化[6-7]等功效，近期研究发现，GPS可抑制心肌细胞肥厚及重构[8]，但在血管平滑肌细胞的作用却罕有报道。因此，本研究的宗旨在于研究GPS对血管平滑肌细胞增殖、迁移是否存在抑制作用，并对其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择4周左右清洁级SD大鼠[合格证号：SYXK(鲁)20130019]，雌雄兼用，体质量180～200 g，由滨州医学院附属医院动物中心提供。

1.2 试剂与仪器 PF-3758309 (Pak4特异性抑制剂)、噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma-Aldrich公司；龙胆苦苷标准品(中国药品生物制品检定所)。兔源抗大鼠Pak4、MMP-2、β-actin 抗体均购于美国Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(中杉金桥生物技术有限公司)；二喹啉甲酸 (BCA)×100蛋白质定量测定试剂盒、组织裂解蛋白提取液、蛋白酶抑制剂均购于上海碧云天生物技术公司；酶标仪(美国Biotech公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；生物显微镜是日本Olympus公司产品；电泳、湿转移槽及Western blot发光照相系统为美国Rio-Red公司产品。

1.3 方法

1.3.1 血管平滑肌细胞培养及分组 组织贴块法培养胸主动脉血管平滑肌细胞。 将大鼠处死后，将胸主动脉取下后剔除外周结缔组织，将胸主动脉剪成小块后放置于培养瓶中，轻轻翻转培养瓶，使培养瓶底朝上。向培养瓶内加入细胞培养基。将培养瓶放于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育3 h，待组织块贴附于瓶底后，翻转培养瓶使得组织块被培养液充分覆盖。7 d后取出培养瓶，更换培养基，观察VSMC的生长情况。此后隔天更换细胞培养基，直至细胞长至融合成片。所有操作过程均为无菌操作。倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长现象，原代VSMC传代培养第4～6代完成纯化后进行分组干预：①对照组：不加特殊处理，仅DMEM培养48 h；②GPS组：给予 200 μg·mL-1GPS培养48 h；③PF-3758309+GPS组：加入PF-3758309(100 μmol·L-1),半小时后再给予200 μg·mL-1GPS培养48 h。

1.3.2 MTT法检测细胞增殖率 将各组VSMC细胞接种于96孔板，并给予上述干预处理。每组设6个复孔，在37 ℃，5% CO2的细胞培养箱内常规培养48 h后，弃细胞培养液，冲洗后加入MTT的培养液(10 μL)孵育4 h，弃去上清液，每孔加入150 mL DMEM。震荡10 min后用酶标仪计于490 nm波长处测定吸光度(A)值，并重复上述实验3次。增殖抑制率=(对照组OD值-各组实验组OD值/对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.3.3 细胞划痕实验检测细胞迁移率 实验步骤依据参考文献[9]。将混匀的血管内皮细胞以5×105均匀种于6孔板内，并铺满整个孔板。各组给予上述相应处理后，以P200移液器枪头垂至于6孔板划出三条平行的“损伤”。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入5%胎牛血清培养基后，放入37 ℃ 5% CO2培养箱培养8 h。运用倒置相差显微镜(Olympus BX61,Japan)对迁移的各组细胞进行拍照，并计算出划痕上下界限之间距离的平均值。经对照组的设定为100%。

1.3.4 Western blot法检测细胞内PAK、MMP-2蛋白表达水平 VSMC细胞的前期培养与干预方案同上。各组细胞处理48 h后用蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白，并根据BCA蛋白定量方法所得结果加入各组蛋白样品。依次通过电泳、转膜、封闭，然后滴加抗Pak4、MMP-2(1∶1 000稀释)4 ℃过夜，清膜、孵育对应二抗后，再次洗膜后用配置新鲜发光液进行曝光显影，Bio-Rad照相系统进行照相并用其附带的软件分析蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 GPS对血管平滑肌细胞增殖率的影响 MTT法结果显示：与对照组相比，GPS组作用细胞后的吸光度明显降低(P<0.01)；与GPS组相比，PF-3758309+GPS组作用细胞后的吸光度明显上升(P<0.05)。表明GPS对血管平滑肌细胞的增殖存在一定的抑制作用，而PF-3758309可以逆转GPS对血管平滑肌增殖的抑制作用(见图1)。

2.2 GPS对血管平滑肌细胞迁移率的影响 划痕实验结果提示：与对照组相比，GPS组细胞划痕实验所致“损伤”边界的距离显著降低(P<0.01)；而与GPS组相比，PF-3758309+GPS组“损伤”边界的距离显著增加(P<0.05)。表明GPS对血管平滑肌细胞的迁移能力存在一定的抑制作用，而PF-3758309可以逆转GPS对血管平滑肌的迁移能力的抑制作用(见图2)。

图2 GPS对血管平滑肌细胞迁移率的影响

2.3 GPS对血管平滑肌细胞内Pak4、 MMP-2蛋白表达水平的影响 Western blot法结果提示：与对照组相比，GPS组细胞内Pak4蛋白表达水平、 MMP-2蛋白表达水平水平明显降低(P<0.01)；而与GPS组相比，PF-3758309+GPS组细胞内MMP-2蛋白表达水平水平明显上升(P<0.05)。表明GPS对血管平滑肌细胞内Pak4、MMP-2蛋白表达水平有一定抑制作用，而PF-3758309可以逆转GPS对血管平滑肌细胞内MMP-2蛋白表达水平的抑制作用(见图3)。

图3 GPS对血管平滑肌细胞内Pak4、MMP-2蛋白表达水平的影响

3 讨论

主动脉夹层是指主动脉腔内血液从主动脉内膜撕裂处进入主动脉中膜，使中膜分离，并沿主动脉长轴方向扩展，形成主动脉壁的二层分离状态,是累及主动脉的灾难性疾病[10]。引起主动脉壁撕裂的主要因素：①主动脉中层有病理改变(基础)；②心脏搏动引起的主动脉运动；③左心室射血对动脉壁的冲击力。囊性中膜坏死、纤维化、弹力纤维变脆是AD特有的组织病理学改变。主动脉中层退行性变被认为是主动脉夹层发病的主要病理基础[3]。主动脉中层由血管平滑肌(SMC)及胶原纤维、黏多糖等构成的细胞外基质(ECM)。因此，抑制 VSMC 过度增殖、迁移及ECM降解是AD形成过程中的重要环节[11]。而降解ECM最主要的酶——基质金属蛋白酶(MMPs)在AD的形成过程中起着十分重要的作用。

GPS属于裂环环烯醚萜苷类化合物，其分子式是C16H20O9，是龙胆属植物的主要药效成分之一。GPS的给药途径也多种多样，龙胆根提取物基本都可以溶解在酒精和水中，所以可以将药物加在酒精酊溶液、酒精溶液和茶中，更容易被患者接受[12]。除了有抗炎、止痛、保肝利胆等作用外。在心血管方面，王戈等[8]发现GPS可抑制心肌细胞肥厚及重构；乔慧莲等[13]发现，GPS可以减轻缺血再灌注致的心肌细胞凋亡。GPS对血管平滑肌细胞增殖、迁移作用及MMP-2表达量是否存在作用却罕有研究。在本研究中对血管平滑肌细胞进行MTT实验、细胞划痕实验，结果显示GPS血管平滑肌细胞的增殖率与迁移率均有一定的抑制作用；在Western blot实验发现GPS可明显降低血管平滑肌细胞内MMP-2、PKA的蛋白表达水平。上述结果表明GPS不仅能抑制血管平滑肌细胞的增殖与迁移，更有可能通过降低MMP-2的蛋白表达水平，阻止细胞外基质的降解，进一步增加了主动脉中层结构的稳定性。且GPS对血管平滑肌细胞增殖及迁移的抑制作用可能与Pak4相关。

P21激活激酶(p-21 activated kinase，Paks)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPaSe) Cdc42/Racl、生长因子信号的下游主要靶蛋白，参与细胞内多个信号转导通路[14]。迄今为止PAK家族共发现6个成员，其中Pak4是首先被发现且目前研究得最深入的成员，它在组织发育过程中及成熟组织中广泛表达，在细胞的生长、生存、增殖及迁移侵袭中起作用[15]。在心血管方面，Pak4 在心脏胚胎发育过程中是必须的，在胚胎时期高表达 而在成熟后表达量明显减少[16]。在血管平滑肌细胞中，GPS可明显降低血管平滑肌细胞内Pak4蛋白表达水平，提示Pak4可能参与GPS对血管平滑肌细胞的增殖与迁移能力的作用。本实验组通过应用PF-3758309(Pak4特异性抑制剂)发现，GPS对血管平滑肌细胞增值率、迁移率及MMP-2蛋白表达水平。PF-3758309可显著逆转由GPS导致的血管平滑肌细胞增殖率、迁移率及细胞内MMP-2蛋白表达水平的抑制作用。进一步提示GPS对血管平滑肌细胞增殖及迁移的抑制作用可能与Pak4相关。

综上所述，本研究发现GPS对血管平滑肌细胞的增殖与迁移存在一定的抑制作用，其作用机制可能通过抑制Pak4降低血管平滑肌细胞内 MMP-2的表达实现的。上述实验为GPS防治主动脉夹层病理过程中血管中层重构提供了部分实验依据。