木槿ISSR-PCR反应体系的建立及优化

任雪羽，王晓红，肖 芬，周 英

(中南林业科技大学 风景园林学院,湖南 长沙 410004)

简单序列重复区间扩增多态性，又称ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子标记技术，是在PCR反应的基础上，利用PCR扩增进行样本检测的DNA分子标记[1]。具有模板需求量少、多态性丰富、操作简单、重复性好、信息量大等优点[2]，现已广泛运用于植物遗传多样性检测[3-5]、亲缘关系分析[6-8]、品种鉴定[9-11]及诱变育种材料的鉴定与选择[12-14]研究中。木槿(HibiscussyriacusL.)为锦葵科木槿属植物，开花于少花的夏秋季节，花大色艳，花期长，是优良的园林观花树种，兼具药用与食用价值。目前，国内主要研究集中在木槿繁殖技术[15-16]、抗性水平[17-18]等方面，对木槿的分子生物学研究较为落后。鉴于此，探索适宜木槿各品种的ISSR-PCR反应体系并进行优化，为开展木槿分子水平研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 于湖南省长沙市中南林业科技大学木槿苗圃中，采集紫花单瓣、马丽娜、白绸、玫瑰红、中国薄绸、紫玉、牡丹木槿、木桥、大白花、薰衣草、哈马博、雅致木槿、薰衣草薄绸、白花重瓣、紫柱、蓝鸟、红心、千层红、红晕、花斑、汉桑、阿娘、茹碧、忠武等24个木槿品种(编号分别为CK和1—23)的顶芽向下第2～4片叶片进行试验。采摘后放入液氮中备用。

1.1.2 生化试剂 320高效植物基因组提取试剂盒(DP320)购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖、Gene Green核酸染料、Taq酶(R001AM)均购自Takara宝日医生物技术(北京)有限公司；ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学UBC公司2006 年公布的引物序列，由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取与检测 使用天根320高效植物基因组DNA 提取试剂盒提取叶片DNA[19]。用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析DNA的完整性，采用BIO-RAD Doc-2000自动凝胶成像系统观察拍照。

1.2.2 ISSR-PCR体系的建立与优化 以紫花单瓣木槿DNA为模板，以初步筛选的UBC899号引物，即5′-CATG(GT)2TGGTCATTGTTCCA-3′，作为固定引物，对影响ISSR-PCR扩增的主要参数进行L16(45)正交试验设计(表1)，每个处理重复2次。各处理总体积为25 μL，均加入2.5 μL 10×buffer(Mg2+free)，不足用超纯水补足。

表1 ISSR-PCR反应体系中各因素的配比设置

在PCR仪(BIO-RAD S1000 Thermal Cycler)上设置扩增程序为：94 ℃预变性2 min； 94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 个循环；72 ℃延伸6 min，4 ℃保温。

根据正交试验筛选出的最优组合进行退火温度单因素试验。温度设置以引物Tm值为基准上下浮动1～2 ℃。设置了50～60 ℃的退火温度区间。

1.2.3 ISSR-PCR产物检测 将10 μL扩增产物与2 μL Loading Buffer混匀，加入1.2%琼脂糖凝胶点样孔中。电压110 V，电泳25 min后于自动凝胶成像系统上观察拍照。对各组扩增条带打分：条带表现清晰稳定，多态性高，记16 分；没有条带，记1 分。

1.3 数据统计

用EXCEL对正交试验的分值进行直观分析，求出同一因素同一水平下的均值ki，及同一因素不同水平下平均值的极差R值。用SPSS 22.0进行正交试验因素间的方差分析及Duncan’s多重比较。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取效果分析

通过凝胶电泳检测，发现提取的木槿DNA质量较好，亮度高，主带清晰，无拖带(图1)，符合后续PCR扩增要求。

图1 部分木槿品种基因组DNA电泳结果Fig.1 Detection of genomic DNA of some materials by electrophoresis

2.2 ISSR-PCR体系的建立与优化

2.2.1 PCR正交试验直观分析 如图2所示，在16个反应组合中，第5、6、9、10组没有扩出条带，其余组合均扩增出可见条带。

极差R值反映不同因素对PCR扩增结果的影响程度。R越大，影响越显著。由表2可以看出，各因素对木槿ISSR(25 μL)反应体系的影响依次为：Mg2+浓度>Taq酶用量>dNTPs浓度>模板DNA用量>引物浓度。平均值ki则反映了因素在该水平下对反应体系的影响程度。结合图2可直观看出，16个组合中，第8组扩增效果最好，其直观分析分值最高。为了进一步确定木槿PCR体系的最优组合，进行方差分析。

泳道1—16分别对应表1正交组合编号;M.D2000 Marker

2.2.2 PCR正交试验方差分析 方差分析结果表明，Taq酶用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度的P小于0.01(表3)，即Taq酶用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度对木槿PCR反应体系有极显著影响。模板DNA用量和引物浓度的P大于0.05，则二者对PCR体系无显著影响。同时，由F值可知，Taq酶用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度三因素对反应体系的重要性与直观分析一致，可对三因素进行多重比较。

表2 不同因素影响下PCR扩增结果直观分析

表3 不同因素影响下PCR扩增结果方差分析

续表3 不同因素影响下PCR扩增结果方差分析

注：**代表在0.01水平差异显著。

Note：** means significant difference at 0.01 level.

Mg2+浓度对反应体系的影响最大，且随浓度增加而上升，当浓度为2.0 mmol/L时均值最高(图3)。同时从泳道条带扩增有无的情况可直观看出Mg2+浓度对于PCR反应体系的重要性，以2.0 mmol/L Mg2+为该体系中最佳水平。

Taq酶用量在PCR反应体系中的影响水平仅次于Mg2+浓度。Taq酶用量过高或过低均易产生非特异性条带，致使条带减弱，清晰度下降[20]。故从经济角度出发，选择0.75 U为Taq酶最佳反应用量。

dNTPs浓度为0.10 mmol/L时与其余三水平有极显著差异，且均值随dNTPs浓度的增加呈先上升后下降的趋势(图3)。从电泳结果来看，泳道2、8、11、13均能扩出较为清晰的条带。故可认为，0.10 mmol/L dNTPs为最佳水平。

图3 不同Mg2+浓度、Taq酶用量、dNTPs浓度下估计边际平均值多重比较分析Fig.3 Multiple comparative analysis of estimated marginal mean values at different Mg2+ concentration, Taq enzyme dosage and dNTPs concentration

2.2.3 退火温度对木槿ISSR-PCR反应体系的影响 50～60 ℃的退火温度区间扩增结果如图4所示，以泳道G、H两者最佳，即50.9、50.0 ℃。其中,50.0 ℃下电泳的条带清晰，亮度高，故选择50.0 ℃作为最佳退火温度。

2.3 木槿最佳ISSR-PCR反应体系和反应程序的验证

以紫花单瓣木槿为对照，对建立的ISSR-PCR反应体系并随机引物UBC 822号进行24个木槿品种扩增验证，电泳结果如图5所示。扩增条带清晰稳定，无拖带，多态性高。证明所得反应体系与反应程序对木槿具有适宜性与稳定性。

A—H泳道退火温度分别为60.0、59.3、58.1、56.3、54.0、52.3、50.9、50.0 ℃;M.D2000 Marker

图5 最佳反应体系并随机引物UBC822号对24个木槿品种的扩增结果Fig.5 Amplification of 24 Hibiscus species by the optimal reaction system with random primer UBC822

3 结论与讨论

目前， ISSR-PCR试验条件常用的优化方法有2种，即单因子优化法和正交试验优化法[20]。单因子优化法是对各影响因素单独研究，拥有操作简单快捷的优点，但工作量大，不能兼顾各影响因素之间的相互作用，故运用较少；而正交试验法，在减少试验次数与工作量的同时，可均衡分散、综合各因素对结果的影响，是一种高效率、快速、经济的试验设计方法，能够较快地找到最优水平组合[21]。

本试验综合运用了2种试验方法，分析了各因素对木槿ISSR-PCR体系的影响，最终得出了适宜木槿ISSR-PCR的反应体系(25 μL)：10×buffer(Mg2+free)2.5 μL、Taq酶0.75 U、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物浓度0.5 μmol/L。最佳退火温度为50.0 ℃。