甘肃省大麦条纹病菌遗传多样性及致病力差异

李葆春 司二静 杨淑莲

摘要 为了解甘肃省大麦条纹病病原菌Pyrenophora graminea的遗传多样性及致病力差异，运用RAPD分子标记技术对大麦条纹病菌不同菌株进行遗传多样性分析，并采用三明治法进行菌株致病力差异研究。结果表明：17个RAPD标记从45个菌株中扩增出126条带，平均每个标记7.41条带，遗传相似系数范围为0.468 3～0.984 1，平均值为0.830 8，当遗传相似系数为0.723 6时，可将供试菌株划分为4个类群，分别包含41、2、1和1个菌株;致病力测定结果显示菌株QWC较菌株QQ致病力强，两菌株除在品种‘甘啤2号和‘GP3上无致病力外，在其他供试品种上致病力均存在差异。表明大麦条纹病菌不同菌株间存在遗传差异，且菌株QWC和菌株QQ存在致病力差异。

关键词 大麦条纹病菌; 随机扩增多态性DNA; 遗传多样性; 致病力差异

中图分类号： S 435.123

文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018287

Abstract The genetic diversity of Pyrenophora graminea collected from different regions in Gansu， was detected with RAPD markers， and the virulence difference between isolate QQ and isolate QWC was tested by the sandwich method. The results showed that a total of 126 fragments were obtained from 45 isolates. Among them， all of the fragments were polymorphic， with an average of 7.41 fragments per RAPD marker. The genetic similarity ranged from 0.468 3 to 0.984 1， with the average of 0.830 8. Isolates in the study were classified into 4 groups at a genetic similarity level of 0.723 6. Virulence test showed that isolate QWC had higher virulence than isolate QQ， and isolate QWC and isolate QQ had virulence difference on all barley varieties except ‘Ganpi 2 and ‘GP3， which were immune to isolate QWC and isolate QQ. The results indicated that there was genetic difference among 45 isolates and a clear virulence differentiation between isolate QWC and isolate QQ.

Key words Pyrenophora graminea; RAPD; genetic diversity; virulence differentiation

大麥作为全球第四大禾谷类作物，与其他麦类作物相比，其抗旱、耐瘠和耐盐性更强，在全世界广泛种植，而我国大麦贸易长期处于净进口状态[1]。经过育种工作者多年的努力，目前已经育成部分品种，缓解了我国啤酒大麦市场的供求矛盾。随着我国人均啤酒消费量的上升、人口的增加以及大麦粮草双高育种目标的提出，对啤用大麦需求进一步加大，但我国大麦生产和发展过程受到大麦条纹病（barley leaf stripe）的影响，该病害是由麦类核腔菌Pyrenophora graminea （anamorph Drechslera graminea）[（Rabenh. ex. Schlech.）Shoemaker]引起的种传病害，在大多数大麦种植地区发生严重，导致大麦严重减产[23]。大麦条纹病主要发生在北美、北非、俄罗斯、欧洲、印度和中国等。国内该病害主要分布在沿长江流域的浙江、江苏、四川、甘肃河西走廊地区以及青藏高原裸大麦区等。近年来大麦条纹病在我国江苏、浙江、四川和湖北等地的重病区平均发病率高达35.3%[4]，河西走廊玉门市发病率达60%，造成30%～40%的产量损失[5]，甘肃省古浪县重病田块发病率达到27%[6]。

大麦条纹病菌遗传多样性分析国内外已有报道，Jawhar等[7]运用12个随机引物对来自叙利亚不同地区的大麦条纹病菌进行RAPD分析，结果表明不同菌株间有明显遗传差异;王春明等[8]运用10个随机引物对甘肃省的11个大麦条纹病菌标样进行RAPD分析，11个供试菌株间遗传距离为0.02～0.31。Bayraktar等[9]对采自不同地区大麦条纹病菌进行ITSRFLP和ISSR分析，ITSRFLP结果显示供试菌株间无差异，而ISSR分析显示供试菌株可划分为4个簇。司二静等[10]利用ISSR标记对甘肃省不同地区的大麦条纹病菌进行遗传多样性分析，结果表明90.24%的片段具有多态性，遗传相似系数为0.44～1，当遗传相似系数为0.68时，可将供试菌株划分为4个类群。

抗病育种是病害防治经济有效的途径，抗性评价是抗病育种的前提条件，而不同菌株间致病力差异给抗性评价带来了很大困扰，只有在明确菌株间致病力差异的基础上才有可能获得准确的抗性评价，国内外关于大麦抗条纹病菌致病力差异已有报道，Tekauz[11]评价了3个菌株对57份大麦品种进行抗性评价，结果表明3个菌株在致病力上存在显著差异，WRS1237致病力最强而WRS1238致病力最弱。Gatti等[12]依据菌丝生长速率、致病力和蛋白类型进行群体变异分析，将供试菌株划分成无致病力、中等致病力和强致病力，且不同致病力的类群拥有不同的蛋白类型。Bayraktar等[9]在48个大麦品种上对13个菌株进行致病力变异分析，结果显示菌株存在很高的致病力变异。吴宽然[13]通过对13个菌株的侵染调查分析，发现各个菌株间的致病力差异较大。司二静等[10]采用三明治法对43个大麦条纹病菌进行致病力差异研究，其中强致病力、中等致病力和弱致病力菌株分别为2个、21个和20个，表明不同菌株间存在明显致病力差异。目前关于甘肃省大麦条纹病菌在不同品种上的致病力差异研究还未见报道。

本研究对来源于甘肃省不同地区、不同年份的大麦条纹病菌运用RAPD标记进行遗传多样性分析，并通过三明治法接种不同大麦品种进行菌株间致病力差异研究，以期为深入开展该病害的流行规律和抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：45个Pyrenophora graminea菌株由甘肃省干旱生境作物学重点实验室麦类种质创新课题组提供，菌株详细信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 45个大麦条纹病菌菌株RAPD分析

不同菌株DNA的提取参考改良CTAB法[910，14]。RAPD引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，菌株间表现多态性的引物信息见表2。PCR扩增体系为10 μL：2×Master Mix 5 μL、10 μmoL/L引物1 μL、60 ng/μL模板1 μL，加ddH2O至10 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s;37℃ 退火30s;72℃延伸2 min，共35个循环;72℃延伸10 min，4℃保存，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 大麦条纹病菌菌株QWC和QQ的致病力测定

致病力测定方法采用三明治法[10，15]，将菌株QWC和QQ分别在PDA培养基上培养7 d，在菌落边缘打取菌饼，置于新PDA培养基上，在22℃下恒温培养7 d，用来接种大麦种子。

种子用70%乙醇处理30 s，再用5%次氯酸钠处理5 min，经无菌水冲洗多次后将种子彻底晾干，然后将种子置于生长7 d的两层菌丝的PDA培养基中间，每个重复接种30粒大麦种子，每个品种3次重复，6℃黑暗放置20 d后转移至直径12 cm花盆，L∥D=12 h∥12 h，培养45 d后待病斑完全显现时进行观察记载每次重复的全部幼苗数，及出现症状的幼苗数。

1.3 数据分析

将电泳结果DNA图谱中清晰且可重复的条带记为“1”，无条带记为“0”，利用软件NTSYSpc 2.10e计算各菌株间遗传相似性系数（genetic similarity，GS），采用UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic mean）法进行聚类分析。

致病力划分参照Bayraktar 等[9]：发病率>70%为强致病力， 20%<发病率≤70%为中等致病力，0<发病率≤20%为弱致病力，发病率=0为无致病力。

2 结果与分析

2.1 45个大麦条纹病菌菌株RAPD分析

17个RAPD引物在45个大麦条纹病菌中共扩增出126条谱带，平均每个引物扩增出7.41条带。不同菌株间的遗传相似系数范围为0.468 3～0.984 1， 菌株HJX1与LB2的遗传相似系数最大，表明二者遗传距离和遗传差异均最小，菌株LB2与NH1的遗传相似系数也较大，为0.976 2。菌株ZYM与QZ的遗传相似系数最小，表明二者遗传距离和遗传差异均最大，菌株YPH与QZ的遗传相似系数也较小，仅为0.484 1。供试菌株遗传相似系数平均值为0.830 8，表明供试菌株间群体遺传差异较小，可能是引物数量较少所致，也可能与菌株主要来源于河西地区有关。

2.2 聚类分析

以UPGMA法对供试的45个菌株构建聚类图，在遗传相似系数为0.540 0时，可划分为2类群，菌株QZ单独为一类群，剩余菌株构成第二类群; 0.723 6时可将供试菌株划分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ为4个类群，分别包含41、2、1和1个菌株，其中菌株DQ2和菌株QZ各为一类，菌株HZZ和ZHZH构成一类，而剩余41个菌株划分为一类（图1）。本研究中菌株来源于不同地区，通过聚类分析发现采集于同一地区的菌株未被聚在一起，如DQ和DQ2均来源于甘肃玉门东渠同一田块的不同感病植株，但被划分在不同类群中，表明菌株DQ和DQ2间存在一定遗传差异，此外来源于内蒙古的菌株SKL与来源于甘肃永昌的XSB聚在一起，遗传相似系数较大，因此基于RAPD分析结果表明大麦条纹病菌菌株类群与菌株的地理来源间没有明显的相关性。

2.3 菌株QWC和QQ的致病力差异

将菌株QWC和QQ分别接种于62份不同来源的大麦品种上研究其致病力差异。结果表明，接种菌株QWC的大麦材料的发病率为0～90.12%，接种菌株QQ的发病率为0～66.67%;在62个大麦品种上接种QWC和QQ平均发病率分别为38.28%和10.04%，分别表现为中等致病力和弱致病力，菌株QWC致病力与菌株QQ相比较强。菌株QWC在62个品种上的致病力表现依次为9个品种上表现强致病力、36个品种上表现为中等致病力和11个品种上表现为弱致病力，6个品种上表现为无致病力;菌株QQ对供试62个品种均未表现出强致病力，在12个品种上表现为中等致病力，30个品种上表现为弱致病力，20个品种上表现为无致病力（表3）。QWC和QQ除在品种‘甘啤2号和‘GP3上表现为无致病力外，在多数品种上致病力差异较大。在整体水平上虽然菌株QWC比菌株QQ致病力强，但是在个别品种上菌株QQ比菌株QWC致病力强，如在‘BARI193和‘内08PJ36上菌株QWC表现为无致病力而菌株QQ表现为中等致病力。基于不同品种对供试菌株的反应差异表明菌株QWC和菌株QQ存在明显的致病力差异。

3 讨论

寄主与病原菌的自身特点及相互关系对抗病育种和病害防治具有非常重要的指导意义，两者是相互斗争相互依存关系，而病原菌遗传多样性和致病力差异对病害防治尤为重要，本研究通过RAPD方法对不同来源的大麦条纹病菌进行遗传多样性分析，并通过人工接种方法对不同菌株进行致病力差异研究。

本研究结果显示RAPD分析可以揭示供试菌株间遗传差异，与Jawhar等[7] 和王春明等[8]的结果较一致，并且本研究选取的引物数量多于前者，本研究筛选到17条在供试菌株间表现多态性引物，而Jawhar等[7]和王春明等[8]分别只筛选到9条和2条多态性RAPD引物。本试验RAPD分析结果显示扩增谱带在菌株间均表现多态性，与王春明等[8]报道的46.15%相比较高，产生此差异可能与本研究中所用菌株数量较多，且地理来源更加丰富有关。菌株GKM采集于甘肃省甘南青稞感病植株，而聚类结果显示菌株GKM与来源于甘肃古浪的菌株SSH遗传差异较小，聚在一起，这与王春明等[8]报道的菌株类群与不同寄主有一定的相关性的研究结论不一致，可能与供试菌株数量有关。本研究结果表明RAPD聚类与河西地区菌株地理来源无相关性，与Bayraktar等[9]的研究结果相一致，造成该现象的原因与大麦条纹病为种传病害有关，同一地区不同地块种子来源地不同，不同种植区域间的种子调运对病原菌在不同地理区域间的传播也起到重要的作用。

本研究通过不同品种经人工接种不同菌株后的发病率对不同菌株进行致病力差异研究，结果显示不同菌株间致病力差异较大，与前人研究结果[10， 13]相一致。司二静等[10]在大麦品种‘Isotta上对43株大麦条纹病菌进行致病力测定，其中菌株QWC和菌株QQ分别划分为强致病力菌株和弱致病力菌株，而本研究选取菌株QWC和菌株QQ在62份大麦上进行致病力测定，结果显示菌株QWC较菌株QQ致病力强，与司二静等[10]的研究结果一致。因菌株QWC和菌株QQ存在明显致病力差异，在部分品种上菌株QWC表现无致病力，但是菌株QQ却能使该品种致病，如‘BARI193和‘内08PJ36。本研究只筛选到品种‘甘啤2号和‘GP3对菌株QWC和菌株QQ均表現为抗病，接种后未发现感病植株，后续应考虑通过构建遗传群体在免疫品种中挖掘抗性基因或QTL，进而更好地为大麦条纹病的抗病育种提供抗性资源。

由于本研究中只选用了40条RAPD引物中多态性较高的17条RAPD对供试菌株进行遗传多样性分析，若要更加详细地进行甘肃省大麦条纹菌的遗传多样性分析，还需进行大量的RAPD引物筛选或采用其他标记方法进行相关研究。 本研究只选用菌株QWC和菌株QQ在不同大麦品种上进行致病力差异研究，后续应选取更多菌株在不同品种上进行致病力差异研究，通过菌株间遗传差异和致病力差异为大麦条纹病抗病育种和病原菌致病机理研究提供理论依据。

参考文献

[1] 李先德，孙致陆，张京.2014年世界和中国大麦生产与贸易形势及2015年展望[J].农业展望，2015，11（2）：4347.

[2] ARABI M I E， JAWHAR M， ALSAFADI B， et al. Yield responses of barley to leaf stripe （Pyrenophora graminea） under experimental conditions in southern Syria [J]. Journal of Phytopathology， 2004， 152（8/9）： 519523.

[3] PORTAPUGLIA A， DELOGU G， VANNACCI G.Pyrenophora graminea on winter barley seed： effect on disease incidence and yield losses[J]. Journal of Phytopathology，1986，117（1）：2633.

[4] 陈桂华，褚金云，金保根，等.金山区大麦条纹病暴发情况及原因分析[J].上海农业科技，2009（5）：134.

[5] 靳生杰，洪平，张丽琼.玉门市大麦条纹病的发生与防治[J].农业科技与信息，2008（13）：3536.

[6] 司二静.大麦条纹病病原菌基因组测序及SSR标记开发[D].兰州：甘肃农业大学，2016.

[7] JAWHAR M， SANGWAN R S， ARABI M I E.Identification of Drechslera graminea isolates by cultural characters and RAPD analysis [J].Cereal Research Communications，2000，28（1）：8793.

[8] 王春明，郑果，洪流，等.甘肃省不同地区大麦条纹病病菌致病力测定及RAPD分析[J].中国植保导刊，2014，34（4）：1014.

[9] BAYRAKTAR H， AKAN K. Genetic characterization of Pyrenophora graminea isolates and the reactions of some barley cultivars to leaf stripe disease under greenhouse conditions[J]. Turkish Journal of Agriculture and Forestry， 2012， 36（2）： 329339.

[10]司二静，杨淑莲，李葆春，等.甘肃省大麦条纹病病原菌致病力分化、rDNAITS及遗传多样性分析[J].植物保护学报，2017，44（1）：8492.

[11]TEKAUZ A. Reaction of Canadian barley cultivars to Pyrenophora graminea， the incitant of leaf stripe [J]. Canadian Journal of Plant Pathology， 1983， 5（4）： 294301.

[12]GATTI A， RIZZA F，DELOGU G， et al. Physiological and biochemical variability[of the barley] in a population of Drechslera graminea[J]. Journal of Genetics & Breeding，1992，46：179186.

[13]吴宽然.大麦条纹病菌种群遗传结构分析及抗性种质鉴定[D].杭州：浙江师范大学，2013.

[14]WEILAND J J， STEFFENSON B J， CARTWRIGHT R D， et al. Identification of molecular genetic markers in Pyrenophora teres f. teres associated with low virulence on ‘Harbin barley[J]. Phytopathology， 1999， 89（2）： 176181.

[15]PECCHIONI N， FACCIOLI P， TOUBIARAHME H， et al. Quantitative resistance to barley leaf stripe （Pyrenophora graminea） is dominated by one major locus[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1996， 93（1/2）： 97101.

（责任编辑：杨明丽）