大叶白麻总黄酮中白麻苷的药代动力学研究

张娟 冯春艳 卿德刚

【摘 要】 目的：建立大鼠血浆中白麻苷的HPLC含量测定方法，借助该法考察白麻苷在大鼠体内的药代动力学特征。方法：XTARRA RP18色谱柱，乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，35℃，1mL/min，360nm检测。6只雄性SD大鼠灌胃给予1.05g/Kg的大叶白麻总黄酮，测定不同给药时间点，动物血浆中白麻苷的浓度，并对其药代动力学参数进行研究。结果：白麻苷在0.0606～19.4040mg/L的范围内线性关系良好（R=0.9996），低、中、高3个浓度样品的相对回收率分别为102.29%、92.95%、90.11%，日内RSD分别为1.53%、1.07%、3.62%，日间RSD分别为8.33%、3.56%、4.03%。大鼠灌胃大叶白麻总黄酮后，白麻苷在大鼠体内的代谢过程符合开放的二室模型，消除半衰期为474.13min。结论：白麻苷在大鼠体内能迅速分布，并且持续时间较长。

【关键词】 大叶白麻;白麻苷;HPLC;药代动力学

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）3-0024-05

Abstract：Objective To establish the content determination method of Quercetin-3-O-sophoroside in plasma， and study the pharmacokinetics feature of Quercetin-3-O-sophoroside in rats. Mehtods XTARRA RP18 column was gradient eluted by acetonitrile-0.2% phosphate solution at 35℃， 1mL/min，360nm. 6 rats were administrated with the purified total flavonoids from Poacynum hendersoniiat a dose of 1.05g/kg， the concentrations of Quercetin-3-O-sophoroside in rat plasma were determined at different administrated time， and calculated the pharmacokinetic parameters. Results Excellent linear relationship was obtained in the range of 0.0606～19.4040mg/L（R=0.9996）， the relative recoveries of low， medium and high concentration samples were 102.29%，92.95% and 90.11%， the intra-day RSD were 1.53%，1.07% and 3.62% ， the inter-day RSD were 8.33%，3.56% and 4.03%.Quercetin-3-O-sophoroside in rats was consistent with the open two-compartment model，the elimination half-life time was 474.13min. Conclusion Quercetin-3- O-sophoroside distributed quickly and existed for a long time in rats.

Keywords：Poacynum henderconii;Quercetin-3-O-sophoroside;HPLC; Pharmacokinetics

白麻属大叶白麻（Poacynum hendersonii Woodson）喜生于盐碱荒地、沙漠及戈壁荒滩等干旱地区，主要分布在新疆、青海、内蒙、甘肃等地区，其中新疆罗布泊、塔里木河、孔雀河畔及阿克苏地区有丰富的大叶白麻野生资源 [1-2]。《维吾尔药志》记载大叶白麻清热凉血、利尿消肿、行气凉肝、镇静安神，用于头晕、心悸、神经衰弱、高血压及肝硬化引起的腹水 [3]。有学者认为，大叶白麻和罗布麻药理活性相似，金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷等黄酮类成分是二者的主要活性成分。然而，近年研究表明，二者在化学组成上有较大差异 [4-9]，比如罗布麻中金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷的含量均高于大叶白麻，并且二者特征成分不同，大叶白麻含白麻苷、芦丁、biapigenin和加贯叶金丝桃素，罗布麻则含querciturone、乙酰金丝桃苷、穗花衫双黄酮等成分 [8-10]。大叶白麻总黄酮由大叶白麻经乙醇提取、大孔树脂柱纯化制得，其抗炎活性优于罗布麻总黄酮 [11]，白麻苷作为其主要成分含量达11.98%，另有研究报道白麻苷具有抗氧化、脑缺血保护等作用 [12-13]。因此，本实验以白麻苷为考察指标，研究大叶白麻总黄酮在大鼠体内的药代动力学特征，以期为大叶白麻的开发利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 U3000高效液相色谱仪（Thermo），MIKRO 220R冷冻离心机（Hettich），XH-C涡旋混合器（江苏金怡仪器科技有限公司），DT2012电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司），AB265-S分析天平（梅特勒-托利多公司），JY92-2D超聲波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 材料 白麻苷（批号：P09J6R1，上海源叶生物科技有限公司），大叶白麻（新疆），甲醇、乙腈为色谱纯（Sigma），超纯水（自制）。

1.3 动物 SPF级SD大鼠10只，雄性，体重为（200±20）g，新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，生产许可证号：SCXK（新）2016-0001。

2 方法

2.1 大叶白麻总黄酮制备 大叶白麻用20倍60%乙醇回流提取2次，每次1.5h，合并2次提取液，浓缩至无醇，过大孔树脂柱，水洗除杂后，以3BV 60%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥，HPLC检测黄酮含量 [14]。

2.2 大鼠血浆中白麻苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：XTARRA RP18（250mm×4.6mm，5μm）;乙腈：0.2%磷酸水溶液梯度洗脱（0～10min，15%∶85%;10～50min，18%∶82%;50～65min，18%∶82%）;柱温：35℃;流速：1mL/min;检测波长：360nm;进样量：100uL。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取白麻苷对照品适量，于10mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成浓度为97.0200mg/L的储备液。分别精密吸取储备液适量，用50%甲醇稀释，制成浓度为97.0200、48.5100、24.2550、19.4040、9.7020、4.8510、2.4255、1.2128、0.6064、0.3032mg/L的系列对照品溶液，4℃保存，备用。

2.2.3 血浆样品预处理 精密吸取大鼠血浆100μl，加入200μL甲醇沉淀蛋白，涡旋2min，13000r/min离心10min，取上清过0.22μm的微孔滤膜，即得。

2.2.4 专属性 将空白血浆、白麻苷添加血浆、灌胃大叶白麻纯化物后血浆，按“2.2.3”项下方法处理，按“2.2.1”项下色谱条件进样，考察方法专属性。

2.2.5 线性关系考察  精密吸取100μL大鼠空白血浆10份，于1.5mL的离心管中，分别加入25μL系列标准溶液，配制成白麻苷浓度为19.4040、9.7020、4.8510、3.8808、1.9404、0.9702、0.4851、0.2426、0.1213、0.0606mg/L的血浆样品，按“2.2.3”项下方法处理，按“2.2.1”项下色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，血药浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.6 精密度实验制备 白麻苷浓度分别为0.4851、3.8808、19.4040mg/L的血浆样品（n=5），按“2.2.3”项下方法处理，按“2.2.1”项下色谱条件进样，连续3d，分别计算日内RSD和日间RSD。

2.2.7 准确度实验制备 白麻苷浓度分别为0.4851、3.8808、19.4040mg/L的血浆样品（n=5），按“2.2.3”项下方法处理，按“2.2.1”项下色谱条件进样，以标准曲线计算浓度和相对回收率。

相对回收率=测定量/实际添加量

2.2.8 基质效应和提取回收率实验 制备白麻苷浓度分别为0.4851、3.8808、19.404mg/L的血浆样品（n=5），按“2.2.3”项下方法处理，按“2.1.1”项下色谱条件进样，峰面积为SET3。取空白血浆，按“2.2.3”项下方法处理，取上清液后加入对照品溶液，使其浓度与SET3一致（n=5），按“2.2.1”项下色谱条件进样，峰面积作为SET2。将对照品溶液用50%甲醇溶液稀释，使其浓度与SET3一致，按“2.2.1”项下色谱条件进样，重复5次，峰面积作为SET1。

基质效应=SET2/SET1提取回收率=SET3/SET2

2.2.9 稳定性实验 制备白麻苷浓度分别为0.4851、3.8808、19.4040mg/L的血浆样品（n=3），室温下放置24h后测定，考察短时稳定性。于-20℃冰冻30d后取出后测定，考察长期稳定性。

2.3 药代动力学实验 雄性SD大鼠10只，灌胃给药前禁食不禁水。4只大鼠作为空白，6只大鼠灌胃大叶白麻总黄酮（1.05g/kg，按白麻苷折算给药剂量为125.79mg/kg），灌胃体积10mL/kg，于给药前后0、5、10、20、30、45min、1、2、3、4、6、8、12h眼眶后静脉丛取血0.5mL，置于1.5mL已肝素化的离心管中，13000r/min离心10min，分离得到血浆，-20℃保存。

2.4 数据处理 数据均用Excel处理，表示为（x±s），药动学参数采用 PK solution 2.0TM（Summit Research Services，USA）药代动力学软件分析。

3 结果

3.1 大叶白麻总黄酮含量测定 HPLC检测，大叶白麻总黄酮中白麻苷、异槲皮苷、紫云英苷、芦丁和金丝桃苷的含量分别为11.98%、7.44%、0.67%、0.30%和0.14%。如图1所示。

3.2 大鼠血浆中白麻苷的含量测定

3.2.1 专属性 白麻苷的保留时间为19.793min，分离度>9，理论塔板数>10000，拖尾因子均符合测定要求，空白血浆中内源性物质不干扰白麻苷的含量测定。如图2所示。

3.2.2 线性关系考察 白麻苷在0.0606～19.4040mg/L的范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.1290869X-0.0310899（R=0.9996）。如图3所示。

3.2.5 基質效应和回收率实验 白麻苷检测基本不受基质干扰，平均提取回收率为97.91%，符合生物样品检测要求。见表2、表3。

3.2.6 稳定性实验 ”低、中、高3个浓度的血浆样品，室温下放置24h后测定RSD分别为4.10%、4.08%和4.26%，-20℃冰冻30d后测定RSD分别为3.93%、3.56%和3.69%，血浆样品短时、长期稳定性良好。

3.3 药代动力学实验 6只大鼠以1.05g/kg剂量的大叶白麻总黄酮灌胃给药，3h后检测不到白麻苷，血药浓度-时间曲线如图4所示。 白麻苷在大鼠体内的代谢过程符合开放的二室模型：吸收速率常数Ka=0.47min，表明白麻苷在胃肠道能很快的被吸收;灌胃后血浆中白麻苷在15min即达峰值CMAX=0.53mg/L，且分布速率常数Kd=0.03min，表明白麻苷进入大鼠体循环后，分布迅速;消除速率常数Ke=0.00 1min，消除半衰期t=474.13min，表明白麻苷在体循环中消除的很慢。见表4。

4 结论

本实验建立了大鼠血浆中白麻苷的HPLC含量测定方法，方法专属性良好、简便易行，相对回收率、精密度、稳定性等均符合生物样品的分析要求。以1.05g/kg剂量的大叶白麻总黄酮提取物灌胃大鼠，其主要成分——白麻苷在体内代谢过程符合开放二室模型，在体内能迅速分布发挥药效，同时持续时间较长。大叶白麻总黄酮的主要成分是白麻苷，并含有异槲皮苷、紫云英苷、芦丁及金丝桃苷。文献报道，大鼠灌胃罗布麻提取物后，血浆中可检测到金丝桃苷和异槲皮苷 [15-16]。笔者在实验中尝试检测大鼠血浆中的金丝桃苷、异槲皮苷、芦丁、紫云英苷，但均未检测到化合物原型，而是出现了其他色谱峰，但是鉴于检测手段的局限性，无法确认代谢产物，这与文献报道有一定差异。一方面可能是由于这些黄酮成分代谢很快，在大鼠体内快速转化为其他成分，另一方面也可能与样品处理及方法检出限有关。

参考文献

[1]张云峰.大花罗布麻化学成分的研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2003.

[2]孟庆艳，刘圆，孔星芸，白红进.不同采收期大花罗布麻叶中总黄酮的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（15）：50-52.

[3]刘勇民.维吾尔药志[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：57.

[4]Haijuan An， Hong Wang， Yuexiang Lan，et al. Simultaneous qualitative and quantitative analysis of phenolic acids and flavonoids for the quality control of Apocynum venetum L. leaves by HPLC-DAD-ESI-IT-TOF-MS and HPLC-DAD[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2013（85）：295-304.

[5]张语迟，刘春明，刘志强，等.罗布白麻与罗布红麻的液相色谱-质谱联用分析[J].分析测试学报，2009，28（10）：1148-1154.

[6]韩利文.中药罗布麻叶及其有效部位的质量控制方法研究[D].太原：山西医科大学，2005.

[7]Chi-On Chan ， Ching-Ching Lau ， Yam-Fung Ng ， et al.Discrimination between Leave of Apocynum venetum and Its Adulterant， A. pictum Based on Antioxidant Assay and Chemical Profiles Combined with Multivariate Statistical Analysis[J]. Antioxidants，2015（4）：359-372.

[8]宋建平，許虎，陈菲，刘训红，等.罗布麻叶黄酮类成分的UPLC-Q-TOF-MS分析[J].中药材，2014，37（7）：1199-1204.

[9]Yuchi Zhang，Chunming Liu，Zhengkun Zhang，et al. Fast differentiation of Apocynum venetum with related species by UPLC/MS and UPLC/SPE/NMR[J]. Med Chem Res ，2012（21）：1077-1083.

[10]强静，李奇，刘训红，等.大花罗布麻叶黄酮类成分的分析[J].新疆中医药，2009，27（5）：31-34.

[11]张娟，卿德刚，倪慧，等.一种具有抗炎活性的大叶白麻纯化物及其应用：中国，CN201810223169.1 [P]. 2018-3-19.

[12]胡运梅，刘春明，胡杨，等.罗布麻叶黄酮类化合物的酸化提取剂PC12细胞保护作用评价[J].时珍国医国药，2013，24（1）：41-43.

[13] Monika A，Olszewska， Anna Presler， et al.Profiling of Phenolic Compounds and Antioxidant Activity of Dry Extracts from the Selected Sorbus Species[J].Molecules，2012（17）： 3093-3113.

[14]冯春艳，卿德刚，倪慧，等.2种罗布麻叶中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的含量比较研究[J].新疆农业科学，2017 ， 54（7）：1291-1297.

[15]梁珊珊.中药罗布麻质量控制及药效成分体内代谢研究[D].上海：第二军医大学，2012.