结核分枝杆菌相关检测试剂盒对结核分枝杆菌感染的诊断价值研究

曾海清，熊君晖，温顺华，林海军，孙旭东

(首都医科大学附属复兴医院检验科,北京 100038;2.厦门万泰凯瑞生物技术有限公司研发部，福建厦门 361022)

结核病是一种由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题[1-5]。据世界卫生组织(WHO)报道，目前全球有近1/3的人感染了MTB，其中我国MTB感染率高达44.5%，远远高于世界平均感染水平[6]。人被MTB感染后，大部分会成为无症状的潜伏性结核感染(LTBI)者；然而当机体免疫力降低时，则会导致MTB大量增殖，引发临床疾病。目前约有10%的潜伏性结核感染者会发展成活动性结核[7]。如何快速诊断和治疗，对防止结核病的传播意义重大。

结核菌素皮试(TST)是最早用于检测MTB感染的方法，但由于易受卡介苗和环境分枝杆菌的干扰，且在结核流行区域的灵敏度和特异度均很低，TST的作用越来越受到限制。近年来，一种利用MTB特有抗原在体外刺激外周血细胞以检测T细胞应答作为MTB感染的诊断方法得到了较快的发展，对检测MTB具有很高的特异度和灵敏度，在欧美国家已经成为结核临床常规检测方法之一[8]。目前该方法的实现方式有2种：一种为酶联免疫斑点法(TB-Elispot)，另一种为体外IFN-γ释放实验(TB-IGRA)。TB-IGRA方法因相对较低的设施条件要求和较好的临床符合率而被美国疾病控制与预防中心(CDC)推荐作为替代TST的更优方法。本试验采用3种国内外主流的检测试剂，对医院确诊的结核病和非结核病患者进行检测，拟评价不同方法对结核病诊断的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1样本来源 评价病例样本来自昆明市第三人民医院、北京市老年医院和厦门市疾病预防控制中心3家临床研究中心，研究获得了各临床研究单位伦理委员会的批准，研究中入组所有病例均与受试者签订了《受试者知情同意书》。三家机构相关数据由万泰公司提供。

1.1.2纳入标准 能够明确的MTB感染情况的人群：包括肺结核临床患者、肺外结核临床患者、普通人群中的无症状潜伏感染者、非结核肺部疾病患者，非结核志愿者。

1.1.2.1肺结核临床患者 诊断原则如下，具备1～6中3项或7～8条中任何1项确诊为肺结核：(1)典型肺结核临床症状和胸部X线表现；(2)抗结核治疗有效；(3)临床可排除其他非结核性肺部疾患；(4)结核菌素(PPD)试验(5TD)强阳性，+++以上(含)；血清抗结核抗体阳性；(5)痰结核菌PCR+探针检测呈阳性；(6)肺外组织病理证实结核病变；(7)BALF检出抗酸分枝杆菌；(8)支气管或肺部组织病理证实结核病变。

1.1.2.2肺外结核临床患者 诊断原则如下，具备1～3中2项可确诊：(1)PPD(5TD)强阳性，+++以上(含)；(2)肺外组织病理证实结核病变；(3)抗结核治疗有效。

1.1.2.3MTB隐性感染者(普通人群中的无症状潜伏感染者) 诊断原则如下，具备1～3中1项可确诊：(1)PPD(5TD)强阳性，+++以上(含)；(2)PPD(5TD)近期阳转；(3)结核病确切接触史，接触时间不少于12个月。

1.1.2.4无结核指征的其他疾病患者 诊断原则如下，具备1～2中2项可确诊：(1)PPD(5TD)一般阳性或阴性，++以下(含)，近期未出现阳转；(2)明确的非结核临床诊断结果。

1.1.2.5无结核指征的普通人 诊断原则如下，具备1～2中1项可确诊：(1)PPD(5TD)一般阳性，++以下(含)，近期未出现阳转；(2)PPD(5TD)阴性；(3)临床诊断未发现结核和肺部疾病。

1.1.3排除标准 (1)年龄小于18岁或大于等于68岁；(2)由MTB以外的其他分枝杆菌致病的患者；(3)免疫损害者(原发性免疫缺陷性疾病、接收放化疗、免疫抑制药物治疗患者)；(4)结核病合并糖尿病患者。

1.1.4样本情况 在本研究中MTB感染者病例共875例，其中包含肺结核临床患者721例，肺外结核临床患者35例，结核合并其他疾病患者样本30例，MTB隐性感染者91例；非MTB感染者共353例，其中包含无结核指征的其他疾病患者91例和无结核指征的普通人262例。本研究中入组样本的数量和组成如表1所示。

表1 样本基本信息表(n)

1.2仪器与试剂 MTB相关γ-干扰素检测试剂盒(体外释放酶联免疫法)(TB-IGRA试剂)为北京万泰生物药业股份有限公司生产；QuantiFERON®-TB(QFT-GIT试剂)为澳大利亚Cellestis Limited公司生产；T-SPOT.TB试剂由Oxford Immunotec公司生产；酶标仪由Bio-Rad公司生产；DEM-3型洗板机由广州市达瑞生物技术股份有限公司生产；ZXDP-B2080型37 ℃恒温箱由上海智城分析仪器制造有限公司生产。

1.3实验方法 将来自同一受试者的新鲜全血样本，分别用北京万泰生物药业股份有限公司生产的MTB相关γ-干扰素检测试剂盒(体外释放酶联免疫法)和澳大利亚Cellestis Limited公司生产的QuantiFERON®-TB试剂盒进行处理和检测，同时随机选取其中部份病例采集新鲜血并采用T-SPOT.TB试剂进行检测。实验操作严格按各厂家试剂盒说明书进行。

1.4统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。灵敏度=结核感染者中检出阳性例数/结核感染者样本总数×100%。特异度=(非结核感染者样本总数-非结核感染者中检出阳性例数)/非结核感染者样本总数×100%。

2 结 果

2.1TB-IGRA、QFT-GIT试剂和T-SPOT.TB试剂的比较分析 两家试剂对875例MTB感染者样本和353例非结合杆菌感染者样本共计1 228例临床样本的检测结果如表2所示，TB-IGRA试剂诊断MTB感染的灵敏度为78.29%(685/875)，特异度为77.05%(272/353)；QFT-GIT试剂诊断MTB感染的灵敏度为74.63%(653/875)，特异度为80.74%(285/353)。TB-IGRA和QFT-GIT试剂在检测灵敏度和特异度方面，差异无统计学意义(P>0.05)。

在上述分析的1 228例病例中，采用T-SPOT.TB试剂对其中随机的132例病例进行了追踪检测，结果如表3所示，TB-IGRA试剂诊断MTB感染的灵敏度为72.60%(53/73)，特异度为45.76%(27/59)；QFT-GIT试剂诊断MTB感染的灵敏度为50.68%(37/73)，特异度为40.68%(24/59)；T-SPOT.TB试剂诊断MTB感染的灵敏度为58.90%(43/73)，特异度为61.02%(36/59)，TB-IGRA、QFT-GIT试剂和T-SPOT.TB试剂在检测灵敏度和特异度方面，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 TB-IGRA与QFT-GIT试剂检验结果判断MTB感染的准确性分析(n)

表3 TB-IGRA、QFT-GIT和T-SPOT.TB试剂检验结果判断MTB感染的准确性分析(n)

表4 TB-IGRA、QFT-GIT试剂与PPD结果比较分析

续表4 TB-IGRA、QFT-GIT试剂与PPD结果比较分析

注：无结果为未进行PPD检测

2.2TB-IGRA、QFT-GIT试剂和T-SPOT.TB试剂与PPD结果比较分析 1 228例临床病例样本中，TB-IGRA、QFT-GIT试剂与PPD结果比较分析汇总如表4所示，PPD不同强弱的对象中，TB-IGRA试剂与QFT-GIT试剂的检出率的差异均无统计学意义(P>0.05)；TB-IGRA试剂、QFT-GIT试剂检出率与PPD结果具有相关性，由弱到强，均呈明显增强趋势，TB-IGRA试剂和QFT-GIT试剂对PPD检测呈阳性的743例病例的检出率分别为65.95%(490/743)，60.83%(452/743)。分析132例T-SPOT.TB试剂检测的随机病例，PPD呈阳性病例中，TB-IGRA试剂检出率为67.47%(56/83)，QFT-GIT试剂检出率为48.19%(40/83)，T-SPOT.TB检出率为54.22%(45/83)，TB-IGRA、QFT-GIT试剂和T-SPOT.TB试剂对PPD阳性样本的检出率方面，差异有统计学意义(P<0.05)，TB-IGRA检出率高于QFT-GIT试剂和T-SPOT.TB试剂。

2.3TB-IGRA、QFT-GIT试剂与细菌培养、涂片结果比较分析 1 228例病例中，合计832例病例有细菌培养和涂片结果，TB-IGRA、QFT-GIT试剂检测结果与细菌培养，涂片结果比较如表6所示。细菌学检测结果不同的对象中，TB-IGRA试剂与QFT-GIT试剂的检出率的差异均无统计学意义(P>0.05)；细菌学检测阳性的对象中，TB-IGRA试剂和QFT-GIT试剂的检出率均高于细菌学阴性对象。分析132例T-SPOT.TB试剂随机检测的病例，具备细菌培养和涂片结果的样本共计45例，3家试剂与细菌培养、涂片结果比较如表7所示，TB-IGRA试剂与T-SPOT.TB试剂之间的检出率差异无统计学意义(P>0.05)，高于QFT-GIT试剂。

表5 TB-IGRA、QFT-GIT和T-SPOT.TB试剂

注：无结果为未进行PPD检测

表6 TB-IGRA、QFT-GIT试剂与细菌培养和涂片结果比较分析

表7 TB-IGRA、QFT-GIT和T-SPOT.TB试剂与

3 讨 论

目前临床对于结核病的诊断主要依赖于临床症状、影像学特征和病原学诊断。患者临床症状和影像学特征有助于疑似患者的发现，但进一步诊断需要结合病原学检测[9-10]。MTB检查是确诊结核病最特异的方法，其中培养法被认为是临床诊断结核病最特异的“金标准”，但该方法一般需2～8周方能获得结果，灵敏度低，且易出现漏检，严重影响结核病的早期诊疗[11-13]。PPD试验的结果是目前国内诊断潜伏感染主要依据，一般将PPD强阳性或短期内从阴性转为阳性，而无临床结核病证据者判断为结核菌潜伏感染者。其最大的缺点在于PPD是从MTB中粗提的抗原混合物，其中包含很多非MTB及卡价菌(BCG)的共同抗原成分，卡介苗的接种会造成假阳性，而人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者等自身免疫性疾病以及免疫力低下的人群中容易出现假阴性[14-15]。因而寻找灵敏度高，检测时间短，特异度好，方便操作的MTB感染检测试剂成为各方研究的重点。细胞免疫介导的MTB γ干扰素释放试验是近年为采用酶联免疫吸附测定或酶联免疫斑点法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对MTB特异度抗原的IFN-γ检测释放反应，用于结核菌潜伏感染的诊断。

在本研究中，通过对多中心临床样本的检测，评价了3种检测特异度抗原介导的细胞免疫反应试剂盒，通过对临床入组的1 228例病例进行检测分析，北京万泰的TB-IGRA试剂和澳大利亚的QFT-GIT试剂在检测肺结核感染的灵敏度和特异度方面差异无统计学意义(P>0.05)，均显示了较高的灵敏度，TB-IGRA试剂诊断MTB感染的灵敏度为78.29%(685/875)，特异度为77.05%(272/353)；QFT-GIT试剂诊断MTB感染的灵敏度为74.63%(653/875)，特异度为80.74%(285/353)。TB-IGRA试剂、QFT-GIT试剂阳性率与PPD结果有相关性，由弱到强，均呈明显增强趋势，与PPD结果比较，TB-IGRA试剂和QFT-GIT试剂对PPD检测呈阳性的743例病例的阳性检出率分别为65.95%(490/743)，60.83%(452/743)。细菌学检测结果不同的对象中，TB-IGRA试剂与QFT-GIT试剂的检出率的差别均无统计学意义(P>0.05)；细菌学检测阳性的对象中，TB-IGRA试剂和QFT-GIT试剂的检出率均高于细菌学阴性对象。对1228例病例分析结果显示，TB-IGRA试剂与QFT-GIT试剂对结核感染的性能一致，差异无统计学意义(P>0.05)。

同时，在研究的1 228例病例中，随机挑选了132例病例采用T-SPOT.TB试剂进行追踪检测，分析此132例病例样本检测结果。TB-IGRA试剂、QFT-GIT试剂和T-SPOT.TB试剂在诊断MTB感染的灵敏度和特异度方面差异无统计学意义(P>0.05)。分析132例T-SPOT.TB检测的PPD呈阳性的病例检测结果，TB-IGRA、QFT-GIT试剂和T-SPOT.TB试剂对PPD阳性样本的检出率方面经χ2检验，差异有统计学意义(P<0.05)，TB-IGRA检出率高于QFT-GIT试剂和T-SPOT.TB试剂。132例病例中具备细菌培养和涂片结果的样本共计45例，TB-IGRA试剂与T-SPOT.TB试剂检测出阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，但高于QFT-GIT试剂。

4 结 论

北京万泰生产的TB-IGRA试剂与QFT-GIT和T-SPOT.TB试剂相比较，在检测MTB感染方面性能无明显差异。但相较于T-SPOT.TB试剂，TB-IGRA试剂与QFT-GIT试剂具有操作相对简单、检测时长更短、结果判读简单等优势，利于医院检验科室的临床检测使用。同时TB-IGRA试剂作为国产试剂，在成本方面比QFT-GIT和T-SPOT.TB试剂具备更明显的优势，可为我国各级医疗卫生单位特别是基层医疗单位的MTB感染诊断提供更大的助力。