新疆维吾尔族、哈萨克族和汉族疼痛敏感性与SLC6A4基因多态性的相关性研究

雷 波，柯雪萍,李新平,柯雪茹,曹兴华△

(1 新疆医科大学附属中医医院手术麻醉科,新疆乌鲁木齐 830001;2 新疆哈密市中心医院内镜室,新疆哈密 839000;3 新疆兵团第七师医院麻醉科，新疆奎屯 833200)

术后疼痛会刺激机体各系统产生不同程度的不良反应，严重影响患者手术后生理和心理的恢复，近年来，越来越多的研究表明，疼痛敏感性在种族间存在差异，并且这种差异显著存在于试验性疼痛和术后疼痛两方面[1-2]。新疆地区是多民族融合的聚居区，主要以维吾尔族、哈萨克族和汉族为主，既往的研究表明，维吾尔族患者疼痛敏感性较高，疼痛耐受较其他民族差[3]。另一方面，多项研究表明5-HT转运体基因(SLC6A4)与疼痛的发生密切相关[4-5]，而SLC6A4基因多态性在这3个民族疼痛敏感性差异中的作用鲜有报道，本研究旨在通过观察新疆地区维吾尔族、哈萨克族及汉族患者疼痛敏感性与患者SLC6A4基因多态性之间的相关性，为预测多民族地区个体术后疼痛程度提供理论依据，实现个体化镇痛治疗。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究选取2017年6月至2018年2月就诊于新疆医科大学附属中医医院拟行结直肠癌根治手术的维吾尔族、哈萨克族和汉族患者各50例，实验方法及实验过程中可能出现的不适均提前告知患者，所有患者均自愿参加本实验并签署知情同意书。本研究由新疆医科大学附属中医医院伦理学委员会批准并监督开展。所有患者的基本资料间差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 研究对象基本资料

1.2纳入、排除标准 纳入标准：符合美国麻醉协会(ASA)分级Ⅰ～Ⅱ级[6]；患者年龄范围在18～55岁之间；肿瘤TNM分期为Ⅰ～Ⅲa期；无既往慢性疼痛史，且无长期服用镇痛药或类皮质醇类药物史；无内分泌、精神或神经系统疾病及其他免疫疾病；无沟通障碍，自愿接受术后静脉自控镇痛(PCA)。排除标准：手术过程出现异常反应，中断术后试验性疼痛检测者；行腹部微创手术者；有长期吸烟、酗酒史者；明显肝、肾功能不全或心血管循环系统疾病者；对本试验过程安全性存在疑虑，无法配合试验者。

1.3手术方法 全部受治患者手术在标准气管内插管全身麻醉下进行，麻醉剂量：咪达唑仑0.05 mg/kg，异丙酚1.5 mg/kg，舒芬太尼0.5 μg/kg，罗库溴铵0.8 mg/kg；术前15 min静脉输注帕瑞昔布纳40 mg、托烷司琼2 mg用以术后疼痛管理及预防术后恶心呕吐。首先进行离心探查，保护切口下结扎肿瘤上、下肠管，按照结直肠癌根治性原则实施结直肠全系膜切除术，将肿瘤上下肠管与结直肠全系膜一起切除，手术全程注意避免挤压肿瘤瘤体，并在无瘤基础上清扫系膜血管根部淋巴结[7]。用纱布多次擦净组织开口处渗液，关腹缝合。

1.4方法

1.4.1SLC6A4基因多态性的检测 DNA提取：所有受试患者于入院后次日清晨空腹采集前臂静脉血1～2 mL，采用DNA抽提试剂盒(DP304，天根)提取血液DNA，操作步骤均严格按照试剂说明书进行；PCR扩增：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测技术(PCR-RFLP)对SLC6A4基因多态性位点进行检测，检测引物由上海生物技术工程有限公司设计并合成，SLC6A4基因多态性目的片段特异性扩增上游引物为5′-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3′，下游引物为5′-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3′。PCR反应体系参照2×Taq PCR MasterMix试剂盒(RTC3104-03，中科瑞泰)说明书。PCR反应条件：95 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s设置40次循环；72 ℃延伸10 min。HpaⅡ酶切检测基因多态性：HpaⅡ限制性内切酶购自上海莼试生物技术有限公司，酶切体系如下：BufferⅠ5 μL，PCR产物2 μL，去离子水加至20 μL，37 ℃水浴过夜。酶切产物行2%琼脂糖凝胶电泳检测基因型多态性后再经测序验证，酶切产物长度为SA：469 bp；SG：402、469 bp；LA：512 bp；LG：402、110 bp。

1.4.2试验性疼痛评估 为保证患者安全，试验性疼痛通过便携式压力测试仪在本院内设有抢救措施的房间内完成。测试区域为患者右前臂内侧腕横纹上2 cm处，通过压力测试仪逐渐以1 kg/s匀速递增的压力刺激1 cm2固定测试区域。根据患者表述，记录患者首次感觉到疼痛压迫时的压力数值，记为压力痛阈(PPT)，以及患者感觉到疼痛无法耐受时的压力数值为压力耐痛阈(PTO)。重复3次测试，每次间隔30 min，计算并记录均值。

1.4.3术后疼痛评估 术前教会所有患者正确使用VAS评分系统[8]，术后立即给予PCA：舒芬太尼1 μg/mL，总负荷量2 mL，输注速度为1.5 mL/h，PCA剂量1 mL，锁定10 min，最大剂量不超过12 mL/h。术后48 h内通过VAS评分系统对患者手术后6、12、24及48 h疼痛程度进行评分。

1.4.4不良反应发生率 记录患者术后48 h内不良反应发生情况。

2 结 果

2.1SLC6A4基因型检测 PCR产物经HpaⅡ限制性内切酶酶切并测序验证后呈现7种基因型，分别为：SA/SA 469 bp；SA/SG 469、402、67 bp；SA/LA 512、469 bp；SA/LG 469、402、110 bp；LA/LA 512 bp；LA/LG 512、402、110 bp；LG/LG 402、110 bp，见图1。根据2种基因多态性对SLC6A4基因转录效率的影响，本研究将纳入的3族患者基因表达情况各归类为高表达5-HT转运体(5-HTT)(LA/LA)、中表达5-HTT(LA/LG、SA/LA)以及低表达5-HTT(SA/SA、LG/SG)3类。经PCR-RFLP检测维吾尔族、哈萨克族和汉族患者SLC6A4基因型和等位基因频率，见表2，维吾尔族患者各基因型的表达频率与汉族对照比较差异有统计学意义(P<0.05)，维吾尔族患者与哈萨克族患者、哈萨克族患者与汉族患者各基因型表达频率间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.23个民族患者PPT及PTO比较 术前试验性疼痛检测表明3个民族患者PPT值差异无统计学意义(P>0.05)，维吾尔族患者PTO值低于哈萨克族患者及汉族患者，差异有统计学意义(P<0.05)。同时分析组间SLC6A4基因型分布与PPT、PTO值间的关系，可以发现低表达5-HTT的患者PPT及PTO值均高于同组其他患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

注：1为SA/SA；2为SA/SG；3为SA/LA；4为SA/LG；5为LA/LA；6为LA/LG；7为LG/LG

图1SLC6A4PCR产物酶切位点检测结果

表2 3组患者SLC6A4基因型和等位基因频率

表3 3组患者术前试验性疼痛PPT和PTO比较

注：与维吾尔族比较,*P<0.05

表4 3组患者术后VAS评分及镇痛不全比例的比较

2.33个民族患者术后VAS评分比较 维吾尔族患者术后6 h VAS评分高于哈萨克族患者和汉族患者,差异有统计学意义(P<0.05)，3组患者术后12、24、48 h VAS评分间差异无统计学意义(P>0.05)。如表4所示，每组患者携带SA/SA、LG/SG基因型，即低表达5-HTT的患者在术后6、12、24及48 h VAS评分均低于其他基因型患者,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4术后患者不良反应发生率 3个民族患者术后不良反应主要为恶心呕吐、抽搐和呼吸抑制，经PCA处理后均能耐受。维吾尔族、哈萨克族、汉族分别有13例(26%)、11例(22%)和11例(22%)患者发生不良反应，3个民族患者间各类和总的不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。详见表5。

表5 术后48 h内3组患者不良反应发生率[n(%)]

3 讨 论

影响疼痛敏感性的因素是复杂的、多方面的，术后急性疼痛会危害患者的胃肠道、心肺、凝血及内分泌等多种功能并诱发各种并发症，危害患者的术后康复和心理状态。人类编码5-HTT的基因SLC6A4的表达水平近年来被证实与慢性疼痛综合症、热痛阈值等密切相关[9]，5-HTT基因型低表达患者痛阈值更高在阿片类药物的镇痛治疗中也显示更好的治疗效果[10-11]，其中5-HTT LPR和rs25531基因型是对5-HTT基因多态性研究的热点，但对于SLC6A4基因多态性在汉族、哈萨克族及维吾尔族民族间的差异鲜有报道。因此本研究从试验性疼痛和术后疼痛2个方面，论证了新疆维吾尔族、哈萨克族和汉族患者疼痛敏感性与SLC6A4基因多态性之间的关系。

SLC6A4基因转录5-HTT LPR起始位点上游1kb的启动子区域存在的43 bp长度的碱基表达缺失与否，形成了S型或L型2种5-HTT等位基因片段，组成了常见的LL、LS和SS 3种基因型。以往的研究表明，等位基因S的表达会降低5-HTT的转录效率，减少细胞膜上5-HTT的富集，从而降低细胞对突触间隙5-HT的重摄取，促进5-HT对后膜受体的结合和作用能力[12-13]。而rs25531是SLC6A4基因转录起始位点与5-HTT LPR连锁遗传的单核苷酸多态性(A>G)，同时G等位基因降低L等位基因的转录活性与S等位基因的作用几乎一致[14]。分别提取维吾尔族、哈萨克族、汉族患者血液DNA检测SLC6A4基因型分布，如图1可以看到，SLC6A4基因PCR产物经HpaⅡ限制性内切酶酶切后共产生SA/SA、SA/SG、SA/LA、SA/LG、LA/LA、LA/LG、LG/LG 7种基因型，综合上述两2种基因多态性对SLC6A4基因转录效率的影响，本研究将所纳入的患者基因表达情况归类为高表达5-HTT(LA/LA)、中表达5-HTT(LA/LG、SA/LA)以及低表达5-HTT(SA/SA、LG/SG)3类。分析3组患者各基因型表达分布，如表2结果表明维吾尔族LA/LA、LA/LG、SA/LA基因型患者显著多于SA/SA和LG/SG型患者，维吾尔族与哈萨克族、汉族患者基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)。通过检验试验性疼痛和患者术后疼痛程度分析3组患者疼痛敏感性与基因间关系，如表3所示，不同民族患者基因型表达差异对PPT无影响，维吾尔族患者PTO低于哈萨克族和汉族患者。同时，比较不同基因型患者PPT、PTO间差异，显示低表达5-HTT基因型患者PPT和PTO高于同组表达其他基因型的患者，差异有统计学意义(P<0.05)。另一方面，前期研究报道，术后体内麻醉药物通过代谢排除体外的过程中，机体通过毛细血管吸收损伤坏死的组织并为修复提供材料，因此术后24 h内痛感最为显著，术后24～48 h疼痛渐弱[15]。因此，通过术后48 h内各组患者VAS评分描述各组患者术后疼痛程度，由表4可知，3组患者术后6～48 h痛感逐渐减弱，与上述文献报道一致。同时，术后6 h维吾尔族患者VAS评分高于汉族和哈萨克族患者，哈萨克族患者与汉族患者间术后6 h VAS评分差异也有统计学意义(P<0.05)；术后12、24、48 h VAS评分各组间差异无统计学意义(P>0.05)；比较同组不同基因型患者术后VAS评分可知，低表达5-HTT的SA/SA、LG/SG基因型患者术后各时间段VAS评分均低于同组其他基因型患者，差异有统计学意义(P<0.05)。同时比较3组患者术后不良反应发生率，3组患者均有不同程度的不良反应发生，差异无统计学意义(P>0.05)。经过对症处理后所有患者不良反应均可耐受。

疼痛是当组织器官受损时，物理和化学炎症因子刺激或激活外周末梢神经上的伤害性感受器，从而传导出疼痛的神经冲动，形成的生理过程。早前研究表明，5-HT等神经递质在疼痛传导、疼痛敏感性中发挥重要作用，5-HT在组织受损后被作为致痛因子释放并作用于脊髓背角相应受体，在疼痛下行抑制通路上发挥重要的调节作用，提高伤害反应的阈值[16-17]。而5-HT在突触间隙的含量主要受5-HTT对其再摄取能力的影响。高表达5-HTT的基因型个体对5-HT再摄取增加，游离的5-HT含量降低相应5-HT1A/2A信号通路收到抑制，疼痛下行抑制系统能力随之减弱增加患者主观痛感[18]。这与本研究中高表达5-HTT基因型的维吾尔族患者个体具有较低的PPT、PTO和较高的VAS评分结果一致。

4 结 论

本研究初步探讨了SLC6A4基因多态性与新疆地区维吾尔族、哈萨克族和汉族民族间疼痛敏感性具有相关性，含有S、G等位基因的个体具有较高的痛阈及耐痛阈。但与此同时，镇痛药物对不同民族或患者的镇痛效果存在的个体差异也不能被忽视，因此，本研究仍需进一步大样本、多地区的研究与验证，最终为本地区实现个体化诊疗，辅助患者预后提供可靠的数据和理论支持。