Th22细胞在系统性红斑狼疮免疫炎性反应中的作用机制研究

梁 华,邱明亮,李晓芳,杨军平,周爱明,肖 亮,杨建安,刘 意

(江西中医药大学附属医院:1.检验科;2.风湿病科;3.药剂科，江西南昌 330006)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种典型的慢性系统性自身免疫性疾病，目前SLE的发病机制尚不明确，而免疫调节异常则是该病发生、发展的重要因素，患者体内T细胞亚群比例失衡，各亚群典型细胞因子分泌水平出现紊乱。T淋巴细胞(Th)22细胞是EYERICH等[1]在2009年新发现的CD4+T细胞功能亚群，它独立于Th1、Th2和Th17，不分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-4、IL-17，而IL-22则是Th22细胞分泌的最主要的细胞因子，其功能主要通过IL-22来实现，芳香烃受体(AhR)是其关键调控转录因子。既往研究表明，Th22细胞可能在皮肤的自稳调节和病理状态中发挥重要作用，同时，Th22细胞在监督和协调引起炎症的免疫细胞过程中起特殊的作用，但Th22细胞在SLE患者中是否存在表达异常及其与狼疮活动和器官损害的关系尚未得到确认。为深入探讨Th22细胞在SLE免疫炎性反应中的作用机制，笔者对SLE患者全血中Th22细胞的频率、外周血清IL-22的水平及其关键转录因子AhR mRNA的表达水平进行了系统研究。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年9月至2016年8月江西中医药大学附属医院风湿科、皮肤科SLE患者46例，其中男6例，女40例，平均年龄(34.5±11.2)岁，诊断均符合1997年美国风湿学会(ACR)修订的SLE分类诊断标准。疾病活动度采用疾病活动指数(SLEDAI)-2000评分系统进行评估，根据临床表现和实验室指标判断，SLEDAI>5归入活动期SLE患者组，SLEDAI<5归入非活动期SLE患者组，但若同时患有以下疾病将从受试者中排除：(1)同时患有除SLE以外的其他自身免疫性疾病；(2)恶性肿瘤；(3)肝脏疾病；(4)其他感染性疾病等；同期选取江西中医药大学附属医院健康体检人员36例作为对照组，其中男3例，女33例，平均年龄(32.2±10.4)岁，所有健康体检人员肝肾功能、血尿常规正常，均无上述所列各类疾病且年龄和性别与活动期SLE患者组及非活动期SLE患者组差异无统计学意义(P>0.05)，本研究方案经江西中医药大学附属医院伦理委员会批准，所有受试者均于采血前签署知情同意书。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 FACS Calibur型流式细胞仪：购自美国BD公司；CFX ConnectTM实时荧光PCR仪；上海伯乐公司产品；Synergy 2型酶标仪：美国BioTek公司制造。

1.2.2试剂 荧光素标记单克隆抗体：抗-CD4-FITC、抗-IFN-γ-PE、抗-IL-22-PeCy5、抗-IL-17-APC均购自eBioScience公司，分别与抗-IFN-γ、抗-IL-22、抗-IL-17相匹配的同型抗体IgG1-PE、IgG1-PeCy5和IgG1-APC，均购自eBioScience公司，以上各抗体均为小鼠抗人单抗；激活剂：佛波醇酯(PMA)和协同刺激剂：钙离子霉素(Ionomycin)、透膜剂均为Sigma公司产品；蛋白转运抑制剂：莫能霉素(Monensin)为eBioScience公司产品；Trizon试剂、RNA提取试剂盒、HiFiScriptcDNA第一链合成试剂盒、PCR扩增试剂盒、Ultra SYBR Mixture均为康为世纪公司产品；AhR RNA引物为上海生工生物工程有限公司合成；IL-22 ELISA试剂盒购自美国Cloud Clone公司。

1.3流式细胞术检测外周血Th22细胞的频率

1.3.1细胞刺激与培养 取各组肝素抗凝全血1 mL，与RPMII 1640培养液1∶1混合后，置培养板培养，加入PMA稀释液5 μL/mL(终浓度100 ng/mL)，Ionomycin 2 μL/mL(终浓度1 μg/mL)，37 ℃，5% CO2静置培养2 h后,再加Monensin 1 μL/mL(终浓度2.5 μmol/L)阻断细胞因子分泌，混匀后继续培养4 h，各实验组均同时设置单加Monensin对照组。

1.3.2细胞表面抗原及胞浆内细胞因子染色 收集培养后的细胞，4℃离心后吸取压积红细胞层100 μL到各流式管中，加入抗-CD4-FITC做细胞表面染色，4 ℃避光反应20 min，经溶血后离心弃上清液，以2%多聚甲醛(PFA)固定30 min，经破膜后最后加入抗-IL-22-PeCy5、抗-IL-17-APC和抗-IFN-γ-PE于检测管内进行胞内染色，同型对照管加入相应匹配的抗人m IgG1-PeCy5、m IgG1-APC和m IgG1-PE，避光冰浴30 min，洗涤、固定、重悬细胞，上流式细胞仪检测，每管收集8万～10万个细胞数据，以同型对照管设定阴性区域，各测定管阳性率减去同型管即为特异度阳性率，CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+细胞为Th22细胞。

1.4RT-PCR法检测外周血中转录因子AhR mRNA 相对表达量

1.4.1标本收集与保存 取各组EDTA-Na2抗凝全血1mL，每管吸取300 μL到RNase-FreeEppendorf管，再加入1 mL Trizon试剂，用移液枪反复吹打或涡旋混合器混合均匀，保存在-80 ℃冰箱备用，防止RNA降解。

1.4.2细胞总RNA的提取 从-80 ℃冰箱中取出样品，待其解冻后，把上清转移到一个新的RNase-Free 离心管中,加入200 μL氯仿，剧烈震荡后静置，离心待其分层，RNA主要在水相层中，把水相层(约500 μL)转移到一个新的预冷的1.5 mL RNase-Free 离心管中，加入等体积预冷的70%乙醇，颠倒混匀，经柱提法离心、洗涤和洗脱后得到RNA，以分光光度计检测260/280比值，均在1.8～2.0之间。

1.4.3逆转录反应 cDNA第一链合成RNA通过逆转录HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒合成cDNA：RNA 7 μL，脱氧核糖核甘三磷酸(dNTP，10 mmol/L)4 μL，引物Primer Mix 2 μL，5× RT Buffer 4 μL，逆转录酶HiFi Script 1 μL，DTT 2 μL，总体系20 μL，反应条件：加入RNA、dNTP、Primer Mix后70 ℃孵育10 min，再放到冰箱中冰浴2 min，再加入5×RT Buffer、HiFi Script、DTT后，50 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min。

1.4.4荧光定量PCR(qRT-PCR) 根据GenBank中目的基因序列按照引物设计原则使用软件Primer Premier 5.0自行设计，经NCBI网站BLAST验证其特异性，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，所用内参为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，引物序列及反应条件见下表1。在PCR反应管依次加入上述cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Ultra SYBR Mixture 12.5 μL，RNase Free dH2O 9.5 μL，总体系25 μL，按以下条件进行扩增：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。扩增结束后采用2-△△Ct法计算相对表达量。

表1 QRT-PCR检测引物序列及扩增范围

1.5ELISA法检测 外周血清IL-22的水平不加抗凝剂抽取各组全血2 mL吸取血清100 μL，按ELISA试剂盒操作说明书进行检测，最低检测限2.8 pg/mL。

2 结 果

2.1Th22细胞占CD4+T细胞的比例 活动期SLE患者组和非活动期SLE患者组外周血Th22细胞的比例均显著低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，同时活动期SLE患者Th22细胞比例显著低于非活动期SLE患者组，差异有统计学意义(P<0.05)，如表2所示，典型流式图见图1所示，R1为淋巴细胞群，以CD4-FITC和IFN-γ-PE分出CD4+IFN-γ-细胞群R2，在IL-22-PeCy5和IL-17-APC点阵图设定G2=R1*R2，分析R2细胞群内IL-22+IL-17-细胞即为Th22细胞(CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+细胞)。

2.2转录因子AhR mRNA的相对表达量 活动期SLE患者组与非活动期SLE患者组AhR mRNA的相对表达量，二者相比较差异无统计学意义(P>0.05)，但无论活动期还是非活动期SLE患者组，均显著低于健康对照组(AhR mRNA的相对表达量为1)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 SLE患者组与健康对照组外周血Th22细胞占

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与非活动期SLE患者比较，▲P<0.05

图1 SLE患者组及健康对照组典型流式图

2.3外周血清IL-22的水平活动期 SLE患者组和非活动期SLE患者组外周血清IL-22的水平分别为167.19、168.78 pg/mL，均显著低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，但活动期SLE患者IL-22的水平与非活动期SLE患者组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表3 活动期SLE组、非活动期SLE组和健康对照组

注：与健康对照组比较，*P<0.05

表4 SLE患者组与健康对照组外周血清

注：与健康对照组比较，*P<0.05

2.4相关性分析 SLE活动期患者外周血中IL-22的水平和AhR mRNA的表达水平均与Th22的细胞比例呈正相关(r=0.849、0.778,P=0.000、0.001)，同时AhR mRNA的表达水平与IL-22的水平呈正相关(r=0.654，P=0.01)，SLE活动期患者Th22细胞比例与SLEDAI指数呈负相关(r=-0.758，P=0.007，但IL-22的水平和AhR mRNA的表达水平均与SLEDAI指数无相关性(P>0.05)。

3 讨 论

通常观点认为，SLE为“B细胞类疾病”即患者体内介导体液免疫的B细胞过度活化导致免疫球蛋白谱改变，自身抗体的大量产生以及补体活化造成的机体损伤[2]，而单纯B细胞的过渡活化必然伴有辅助性Th的协助方可引起SLE的炎性反应，因此，T细胞的异常活化和Th细胞异常分泌细胞因子则被认为是SLE发病的关键因素。Th22细胞则是新近发现的一种独立Th细胞亚群[1]，其关键转录因子是AhR，主要分泌IL-22、IL-26、IL-13等细胞因子[3]，同时IL-6、TNF-α共同对Th22细胞的分化起诱导作用。Th22细胞在自身免疫病和炎症性疾病中发挥重要作用，主要通过激活后分泌大量的IL-22来实现[4-5]。在正常情况下，Th22细胞与Th17细胞、Treg细胞及其他细胞亚群互相调控，使机体处于免疫平衡状态，在慢性炎性疾病中，Th22细胞功能丧失，将使慢性炎性疾病恶化。

作为Th22细胞调节分化的关键转录因子，AhR在生物中的表达非常广泛，并且具有高度保守性，其参与调控编码细胞色素P450蛋白，在机体的多种生理机能及疾病的进展中发挥一定的作用，许多自身免疫性疾病的发生可能与AhR配体及毒物代谢酶的活性有关[6],并且其可以调控Th17细胞和Treg细胞的分化[7]，这使得AhR在免疫学领域中引起了越来越多的关注。

在本研究中，笔者不仅聚焦在SLE患者中Th22细胞的表达，还同时探讨其上游调控分化的转录因子AhR对SLE的影响及与Th22的关系，并观察了其下游的表达产物IL-22在SLE血清中的表达及与Th22的关系，以期能较为全面分析Th22细胞在SLE炎性反应中的作用机制。笔者发现活动期SLE患者组和非活动期SLE患者组Th22细胞比例均显著低于健康对照组，同时活动期SLE患者组的Th22细胞比例显著低于非活动期患者组，这说明Th22细胞的表达频率与SLE疾病的进展和活动度有一定的关系，进一步的相关分析表明，Th22细胞的比例与SLE的疾病活动度指数SLEDAI之间存在负相关关系。该结果与YANG等[3]报道的结果略有不同，后者对SLE并发的器官损害进行了分类，尤其以合并肾炎患者Th22细胞表达显著降低，但对合并皮肤损害的患者Th22的比例增高。

对Th22细胞下游功能分子IL-22的检测发现，SLE患者血清IL-22的水平显著低于健康对照组，但活动期组与非活动期组之间差异无统计学意义，IL-22的水平与SLEDAI无相关性，该结果与岳林环等[8]报道的结果基本一致。IL-22是Th22细胞最重要的效应因子，IL-22有多种细胞来源，Th22、Th1、Th17细胞及其他淋巴细胞都能分泌表达IL-22，相关分析表明，IL-22与Th22细胞呈正相关，这提示在SLE患者中，IL-22主要来源于Th22细胞，因此研究IL-22在SLE 中的作用对揭示Th22细胞在SLE的发病和进程的作用至关重要。另一方面，多种细胞因子的网络调控效应对不同SLE病程阶段的影响也会不同，可能尚存有其他调控机制导致活动期SLE与非活动期SLE的IL-22的水平差异无统计学意义。

本研究采用qRT-PCR技术证实了外周血淋巴细胞中AhRmRNA的表达水平在SLE中显著降低，相关分析表明，作为Th22细胞上游调控关键转录因子，其表达水平与Th22细胞频率呈显著正相关，这也提示AhR可能通过干扰淋巴细胞活化和功能进而促进SLE疾病发病。有研究显示，多种炎性细胞因子包括IL-22及其受体、受体相关蛋白基因的启动子或增强子区域，具有AhR结合序列的DRE位点，进而AhR能直接或间接调控炎性细胞因子的产生和分泌[9-10]。本研究的结果也证实了这一点，AhR在SLE显著降低，影响到下游IL-22的产生和分泌，其水平也显著低于健康对照，进一步的相关分析表明，二者存在正相关，由此可以推见，AhR可能是SLE调控免疫反应，控制炎症效应的关键分子。而在活动期SLE组和非活动期SLE组患者，AhR的表达水平差异无统计学意义，并且AhR的表达与SLEDAI指数无显著相关性，这可能源于有部分患者在临床诊疗过程中或疾病早期未确诊之前自行服用激素或免疫

抑制剂而干扰SLE典型症状的出现，这对疾病活动度的判断可能产生较大影响。当然，这还需要大样本的研究以了解这些指标的相关性。

4 结 论

SLE患者Th22细胞表达降低，可能源于AhR直接或间接调控炎性细胞因子的产生和分泌，从而导致不同免疫细胞亚群的免疫失衡，这也提示改变或促进Th22细胞分化的上游或下游通路可能减轻SLE的免疫炎性反应，Th22细胞水平可以作为SLE诊疗的潜在靶点和辅助标志物。