清热除湿止痛液的提取工艺研究

潘从泽 李喜香 董云霞 冯彦俊

基金项目：2015 年中医药行业科研专项项目（项目编号：2015468001）。

作者简介：潘从泽（1984-），男，汉族，硕士，中药师，研究方向为中药制剂的研究。E-mail：pancongze@163.com

通信作者：

【摘 要】 目的：优选清热除湿止痛液的提取工艺。方法：以龙胆苦苷含量为指标，采用L9（34）正交试验来考察加水倍量、提取次数和提取时间对龙胆苦苷的影响。结果：最佳提取工艺为加水量8倍，提取3次，每次提取50min。结论：优选出的提取工艺稳定、可行、重复性好，可作为清热除湿止痛液的提取工艺。

【关键词】 龙胆苦苷;提取工艺;正交试验

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）7-0024-03

Study on the Extraction Technology of Qingre Chushi Zhitong Ye

PAN Congze1 LI Xixiang1 DONG Yunxia2 FENG Yanjun1

1 Gansu Provincial Hospital Of TCM，Lanzhou 730050，China;2 Pulmonary Hospital Of Lanzhou，Lanzhou 730050，China

Abstract：Objective To optimize the extraction process of Qingre Chushi Zhitong Ye. Methods Taking the content of gentiopicroside as the index，the L9 （34） orthogonal test was used to investigate the effect of water addition， extraction times and extraction time on Gentiopicroside. Results The best extraction process is 8 times of water addition， 3 times of extraction， 50 minutes each time. Conclusion The preferred extraction process is stable，feasible，and reproducible，and can be used as an extraction process for Qingre Chushi Zhitong Ye .

Keywords：Gentiopicroside;Extraction Process;Orthogonal Test

清熱除湿止痛液是甘肃省中医院协定处方制剂，由秦艽、忍冬藤、防己等十味中药组成，具有清热除湿，通络止痛的功效，用于治疗风湿性、类风湿性关节炎、痛风性关节炎，强直性脊柱炎、肩周炎、颈椎病等属风湿热痹、出现关节疼痛，局部红肿灼热等症。历经多年临床应用效果明显，可显著改善风湿热痹型膝骨关节炎患者关节疼痛、活动受限、局部肿胀，发热等局部和全身症状[1]。现拟将传统汤剂改为便于服用的合剂，对其提取工艺进行研究，转化为医院制剂，更好的为临床服务。方药中秦艽为祛风湿热药，指标成分为龙胆苦苷，具有镇静、镇痛、解热、抗炎等作用[2-4]。本实验采用正交试验，以龙胆苦苷为评判指标，对清热除湿止痛液进行提取工艺优化，找到最佳提取条件，对实际生产有一定指导意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters 2695型HPLC仪，Waters 2998型光电二极管阵列检测器（美国Waters公司）;ABT100-5M电子天平（KERN德国）;MH-5000型可调式电热套（武汉格莱莫检测设备有限公司）;AKRY-UP-1816超纯化水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司）;RE 5298A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）;SB-5200DTR超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 材料 秦艽、忍冬藤、防己等十味药材均购于兰州安泰堂中药饮片有限公司，经甘肃省中医院李喜香主任中药师鉴定，符合2015版《中国药典》药材项下规定;龙胆苦苷对照品（批号110770-201716，中国食品药品检定研究院），甲醇为色谱纯（批号20171204，天津市福晨化学试剂厂），其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 含量测定[4-7]

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters Symm-etry-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：甲醇：水=30∶[KG-*3/5]70;流速1.0 mL/min;检测波长：274 nm;柱温：25 ℃。在上述色谱条件下，理论板数以龙胆苦苷峰计应不少于4000，分离度>1.5，龙胆苦苷对照品、清热除湿止痛液供试品及阴性样品色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取龙胆苦苷对照品1.08 mg置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。

2.1.3 供试品溶液的制备 按处方比例称取9份含秦艽、忍冬藤、防己等十味药材的混合饮片（78 g），按拟定的正交试验设计进行水煎煮提取，滤过后浓缩至适量，加入乙醇，使含醇量达55%，静置16小时，抽取上清液，回收乙醇至无醇味，加纯化水至100 mL，得到清热除湿止痛液。精密量取10 mL清热除止痛液置于100 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，微孔滤膜滤过，滤液即为供试品溶液。

2.1.4 阴性样品溶液的制备 按清热除湿止痛液处方和制备工艺制备缺秦艽的阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.1.5 线性关系的考察 分别精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液2.5、5、10、15、20 μL，按上述色谱条件依次进样，以进样量（μL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。其线性回归方程为：y=1727.83438x+15.00419，r=0.99994（n=5）线性范围：0.52～4.16μg。

2.1.6 精密度试验 精密吸取“2.1.2” 项下对照品溶液10μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，龙胆苦苷峰面积的RSD为1.24%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取“2.1.3” 项下供试品溶液10μL，分别与放置在0、2、6、10、14、24h时进样测定，记录峰面积。结果，龙胆苦苷峰面积的RSD为1.39%（n=6），表明样品溶液在24h内稳定。

2.1.8 重复性试验 按处方比例称取处方药材78g，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，龙胆苦苷峰面积的RSD为1.71%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 按处方比例称取秦艽、忍冬藤、防己等十味药材混合饮片39 g，平行9份，平均分为3组，每组分别按清热除湿止痛液中龙胆苦苷含量的80%，100%，120%精密加入龙胆苦苷对照品，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，共9份，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果，平均加样回收率为99.48%，RSD=1.67%（n=9），表明该方法可行。结果见表1。

2.2 正交试验 以提取时间（A）、加水倍量（B）、空白（C）及提取次数（D）为考察因素[8-9]，以龙胆苦苷含量为指标，按正交L9（34）进行试验，因素水平、正交试验设计及结果和方差分析分别见表2、表3和表4。

由极差分析结果可以得出，各因素对龙胆苦苷含量影响的大小顺序为： A（提取时间）>B（加水倍量）>D（提取次数），其最佳工艺为A2B1D2。

由方差分析结果可知，提取时间（A）和加水倍量（B）差异均有显著统计学意义（P<0.01），而提取次数（D）差异无统计学意义（P﹥0.05）。考虑到药材的提取效果，确定提取次数为3倍，得出最佳提取工艺为A2B1D3，即加水量8倍，提取3次，每次提取50min。

2.3 验证试验 按照最佳提取工艺A2B1D3分别提取三批处方量药材进行验证试验，按照“2.1.3” 项下方法测定龙胆苦苷的含量，取平均值，结果优于或近似于正交试验的数据。验证结果见表5。

3 讨论

清热除湿止痛液是由秦艽、忍冬藤、络石藤、桑寄生、薏苡仁等10味中药制成的复方制剂，其中秦艽为君药，传统用于风湿痹痛、筋脉拘挛、骨节酸痛等病症，广泛用于风湿病的治疗，在本院治疗膝骨关节炎疾病的众多案例中，取得了良好的临床效果[1]。秦艽药材中的主要成分以龙胆苦苷为主的裂环环烯醚萜苷类化合物，而龙胆苦苷为其指标性成分[10]，选其为含量测定指标，且对清热除止痛液质量标准的进一步研究有一定的参考作用。

本实验通过正交试验设计对清热除湿止痛液提取工艺进行优化筛选，通过测定龙胆苦苷的含量来评价其内在质量，确定了最佳的提取工藝为加水量8倍，提取3次，每次提取50min，适合实际生产，可作为后续研究的基础和参考。

参考文献

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（收稿日期：2019-02-13 编辑：程鹏飞）