超声波辅助酶法提取葡萄皮渣多酚工艺优化

陈瑞喜,王璐璐,+,陈德蓉,雷芳萍,杨学山,2,祝 霞,2,*

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070; 2.甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室,甘肃兰州 730070)

甘肃省河西走廊葡萄酒产区因其得天独厚的地理条件(北纬36～40°),非常适合酿酒葡萄的栽培,酿酒葡萄种植面积超过30万亩,年产量达2.41万吨[1]。与此同时,酿酒后葡萄皮渣的产量也逐年增长[2],大部分酒厂将皮渣直接废弃或闲置堆积,只有少量用作田间肥料、动物饲料或当燃料处理,不仅造成资源的大量浪费,同时对环境造成了严重污染[3]。

葡萄酿酒后的皮渣主要由葡萄皮(78%)和葡萄籽(16%)组成,含有大量多酚化合物、芳香化合物、葡萄籽油和膳食纤维等许多高营养价值的化合物[4-5]。研究表明,多酚类物质具有抗氧化和清除自由基的特性,对癌症、糖尿病和动脉粥样硬化等疾病的预防具有积极作用[6-7],多酚提取物的抗氧化效果为VC的50倍,VE的20倍[8-10],具有较强的资源化开发潜力。多酚化合物的提取多采用有机溶剂提取法,该方法溶剂消耗量大,操作费时,且提取物中含有溶剂残留,使多酚化合物的实际应用受到限制[11]。超声波是一种弹性机械波,其萃取效果主要取决于它在溶剂中产生的空化效应和机械效应,能够使溶剂最大程度地渗透到样品基质中,增加固相和液相之间的接触面积,从而使样品中的有效成分迅速溶解到溶剂中[12-13];生物酶能够水解植物纤维等组织,破坏植物细胞壁,进而充分释放细胞内含物,有利于植物生物活性物质的提取,从而提高葡萄皮渣的利用价值[14]。超声波辅助酶法可使生物活性成分提取过程更加简单有效,并能有效提高提取的安全性,但目前采用超声波辅助酶法提取葡萄酒皮渣中多酚的研究还未见报道。

本实验以甘肃河西走廊产区酿酒葡萄主栽品种赤霞珠(Cabernet Sauvignon)酿酒后的皮渣为原料,对超声波辅助酶法提取多酚的工艺条件进行优化,以期确定最佳提取工艺参数,为葡萄酒皮渣资源的合理开发利用提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赤霞珠葡萄酒皮渣 于2017年11月采自甘肃农业大学食品学院葡萄酒生产车间酒精发酵结束后皮渣;纤维素酶 酶活力400 U/mg,上海源叶生物科技有限公司;Folin-Ciocalteus显色剂 北京索莱宝科技有限公司;氢氧化钠 天津市百世化工有限公司;无水碳酸钠 天津开发区海光化学制药厂;没食子酸 上海鼓臣生物科技有限公司。

SCIENTZ IID型超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;TU-1810紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;TD5A-WS台式低速离心机 东莞康润实验科技有限公司;CPJ214电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;恒温水浴箱 北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄皮渣预处理 将酒精发酵结束后的赤霞珠葡萄酒皮渣经手工去籽后,置于鼓风干燥箱中60 ℃干燥24 h,粉碎机粉碎后得到葡萄皮粉末作为实验原料备用。

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 超声时间对多酚得率的影响 准确称取预先处理好的葡萄酒皮渣粉各0.500 g并溶于40 mL水中,加入纤维素酶25 mg,设置超声功率300 W,超声时间分别为5、10、15、20、25 min,在酶解温度60 ℃、pH5.5的条件下酶解2.5 h。测定多酚得率，选出较佳超声时间。

1.2.2.2 超声功率对多酚得率的影响 超声时间10 min,设置超声功率分别为100、200、300、400、500 W,其他操作同1.2.2.1。测定多酚得率,选出较佳超声功率。

1.2.2.3 酶解pH对多酚得率的影响 在超声时间10 min,超声功率300 W,酶解温度60 ℃的条件下,调节酶解pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,其他操作同1.2.2.1。测定多酚得率,选择较佳酶解pH。

1.2.2.4 酶解温度对多酚得率的影响 在超声时间10 min、超声功率300 W、酶解pH5.5的条件下,设置酶解温度分别为50、55、60、65、70 ℃,其他操作同1.2.2.1。测定多酚得率,选出较佳酶解温度。

1.2.3 正交试验 根据单因素实验结果,选取超声时间、超声功率、酶解pH、酶解温度为实验因素,采用L9(34)正交表,做四因素三水平正交实验。通过测定各组样品多酚得率,选出最佳工艺条件。试验因素和水平设计见表1。

表1 正交试验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 葡萄皮渣多酚的测定 采用福林-肖卡法[15]测定葡萄皮渣多酚。吸取1 mL样品溶液,加入5 mL蒸馏水、1 mL Folin-Ciocalteus显色剂和3 mL 7.5% Na2CO3溶液。阴暗处室温条件下放置2 h显色后,在765 nm波长下测定吸光度,再根据总酚标准曲线方程(y=0.0775x+0.0032,R2=0.9985)计算样品中多酚的得率。葡萄酒皮渣中多酚得率按以下公式计算:

式中,ω为多酚得率,%;C为根据标准曲线计算得到的多酚质量浓度,μg/mL;V为提取液的体积,mL;m为葡萄皮渣的质量,g。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 20.0处理数据并作图,结果以平均值表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声时间对多酚得率的影响 由图1可知,不同超声时间对葡萄皮渣中多酚得率影响显著(p<0.05),随着超声时间的延长,葡萄皮渣中多酚得率增加,在超声10 min时达到最大值(1.304%),之后超声时间再增加,多酚得率显著下降。这表明当超声时间达到10 min时,葡萄皮渣中多酚化合物已充分浸出,提取量接近饱和,继续延长超声时间可使更多杂质溶出,加速多酚氧化,增加提取成本,并使葡萄皮渣中多酚得率减小[16]。因此,超声时间宜选用10 min。

图1 超声时间对多酚得率的影响Fig.1 Effect of the ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.1.2 超声功率对多酚得率的影响 不同的超声功率对葡萄皮渣多酚得率的影响较大。如图2所示,随着超声功率的不断增大,葡萄皮渣中多酚得率也随之增加,当超声功率为300 W时,多酚得率最高。当超声功率超过300 W时,多酚得率呈显著下降(p<0.05)。这主要是由于超声功率的大小会直接影响超声波的机械效应和空化效应。当超声功率增大时,其机械效应和空化效应相应增强,从而增大介质分子的运动速度、强化介质的扩散、传播,使多酚物质充分溶出,增加得率[17]。但当超声功率过大,其强烈的空化效应易破坏目标产物,局部高温易使多酚氧化分解,进而使多酚得率下降[11]。后续实验选择超声功率300 W为宜。

图2 超声功率对多酚得率的影响Fig.2 Effect of the ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.1.3 酶解pH对多酚得率的影响 如图3所示,在pH4.0～5.0的条件下,多酚得率差异性较小,在pH为5.5时,多酚得率达到最大值;当pH超过5.5时,多酚得率显著下降,且在pH6.0和pH6.5时,多酚得率无显著性差异(p>0.05)。这可能与纤维素酶的最适酶解pH有关,当pH为5.5时,纤维素酶酶活力达到最大值,能够充分水解植物纤维,破坏植物细胞壁,进而充分释放细胞内的多酚物质;当pH超过纤维素酶的最适pH范围时,其酶活性大大降低,且过高的pH可能会改变底物的解离状态,从而影响酶与底物的充分结合,最终使多酚得率下降[14],因此选择较佳的酶解pH为5.5。

图3 酶解pH对多酚得率的影响Fig.3 Effect of the enzymolysis pH on the yield of polyphenols

2.1.4 酶解温度对多酚得率的影响 由图4可知,在酶解温度为55 ℃时,多酚得率达到最大值,超过55 ℃后,多酚得率不再增加,其中70 ℃时多酚得率最小。适宜的高温能够促进多酚物质的充分溶解,但由于多酚物质在高温下不稳定,易被氧化分解,因此,过高的温度反而使多酚得率下降[18]。选择55 ℃为较优酶解温度。

图4 酶解温度对多酚得率的影响Fig.4 Effect of the enzymolysis temperature on the yield of polyphenols

2.2 正交试验

根据单因素实验结果,选取超声时间、超声功率、酶解pH、酶解温度为实验因素,进行L9(34)正交试验,并应用SPSS 20.0对正交试验结果进行方差分析。结果如表2、表3所示。

表2 正交试验结果Table 2 Results of the orthogonal design

表3 方差分析表Table 3 Results of variance Analysis

通过正交试验结果(表2)直观分析可知,影响赤霞珠葡萄皮渣中多酚得率的主次因素依次为A>D>B>C,即超声时间>酶解温度>超声功率>酶解pH。通过方差分析(表3)可知,因素A差异显著(p<0.05),即超声时间对葡萄皮渣多酚得率具有显著性影响。试验确定超声波辅助酶法提取赤霞珠葡萄皮渣中多酚的最佳工艺条件为A3B3C3D3,即超声时间15 min,超声功率400 W,酶解pH6.0,酶解温度60 ℃。

2.3 工艺条件验证

对正交试验得到的最佳工艺条件进行验证实验,在最佳工艺条件下,进行三次重复实验,得到赤霞珠葡萄皮渣中多酚的平均得率为1.493%±0.0068%,其结果高于正交试验中任一组合的多酚得率,表明正交试验确定组合为提取赤霞珠葡萄皮渣中多酚的最佳工艺参数。

3 结论

本实验通过单因素实验,并采用L9(34)正交试验设计对赤霞珠葡萄皮渣多酚的提取条件进行了优化,确定最佳提取工艺参数为:超声时间15 min,超声功率400 W,酶解pH6.0,酶解温度60 ℃,在此条件下多酚得率达1.493%±0.0068%。超声波辅助酶法提取葡萄皮渣多酚具有工艺稳定可行,环保节能且能够保持葡萄皮渣中的有效活性成分等优点,是提取葡萄皮渣多酚的有效途径。