MMP-2、MMP-9与脑动脉畸形的相关性研究*

毛中臣，付志新，孙 永，赵 燕，陈卡佳

开封市中心医院 神内重症科(开封 475000)

脑血管畸形是一种脑血管先天性、非肿瘤性血管疾病，主要表现为脑局部血管数量和结构异常，并引起脑血流异常。近年来人们对脑血管畸形的认识及治疗方法的研究越来越深入。脑动静脉畸形常发生于20～40岁青年患者，研究[1-2]发现男女发病率相当。脑动静脉畸形患者主要症状有癫痫、出血、头痛及其他局灶性神经功能障碍，症状可单独存在，也可合并发生[3-7]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一组依赖于锌、钙离子的蛋白水解酶，能够促进细胞外基质的降解和重构。MMPs能够降解构成细胞外基质，主要包括胶原蛋白、非胶原蛋白和弹性蛋白，因此MMPs对血管重塑起关键作用。其中，基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)与缺血性脑损伤的发生、发展关系密切[8-10]。MMP-2又称明胶酶A，大量研究[11-13]表明，MMP-2是细胞外基质合成和降解代谢过程中的关键因子。MMP-9是MMPs家族中重要的成员之一，其能够降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原蛋白，是脑基底膜降解过程中的重要因素之一[14]。本研究主要对MMP-2和MMP-9在脑动脉畸形患者中的表达进行研究，以期为脑动脉畸形的治疗提供新的靶点和治疗方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年1月至2018年6月开封市中心医院收治的脑动脉畸形患者30例为观察组，纳入标准为：1)患者自愿参加试验，愿意随访者；2)临床资料完整，实验室检查齐全；3)首次确诊为脑动脉畸形者。排除标准为：1)重要脏器功能不全者，伴有其他自身免疫系统疾病者；2)临床资料不完整缺项者；3)伴有血液系统、自身免疫系统疾病者；4)伴有高血压、高血脂及糖尿病等血管疾病者。观察组男16例，女14例；年龄25～68(42.7±8.1)岁。选取同期脑外伤非血管性疾病患者18例为对照组，均经CT及MRI证实为非血管性疾病的外伤患者，排除标准：无高血压、高血脂及糖尿病等血管疾病病史。对照组男8例，女10例；年龄23～61(45.5±7.8)岁。收集观察组和对照组患者的血清和手术切除的标本。本研究经开封市中心医院伦理委员会审核同意。两组患者在性别、年龄方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 试剂材料

BCA蛋白定量试剂盒、细胞裂解液(南通碧云天生物技术研究所)；MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗、HRP标记二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；引物合成、逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒(大连TaKaRa)；免疫组织化学染色试剂盒SP-9001(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中MMP-2和MMP-9含量

观察组与对照组患者均于清晨，空腹抽取3～5 mL静脉血，离心机离心10 min(2 500 r/min)，离心半径25 cm。小心吸取上层血清，立即存放于-20 ℃冰箱保存待用。采用ELISA法检测血清中MMP-2和MMP-9的含量，实验操作按照说明书操作，每个样品重复检测3次。

1.4 RT-PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA在脑动脉标本中的转录水平

取材后部分标本置于-80 ℃保存待用，取各组标本样品约50 mg，根据试剂盒中提供的方法提取待测组织中的总RNA，并检测RNA的质量浓度和质量分数，以吸光度值A260/A280比值为1.8～2.0时视为合格，按照试剂盒说明书操作方法进行逆转录，然后加入引物(表2)，PCR定量检测mRNA的转录水平，选取GAPDH作为内参，反应条件为：94 ℃ 5 min；然后94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，总共扩增30个循环；72 ℃ 5 min。

表2 RT-PCR引物序列

1.5 Western blot检测MMP-2和MMP-9在脑动脉标本中的表达

分别从两组中取样约50 mg，加入含蛋白酶抑制剂的组织裂解液，置于冰上充分研磨。4 ℃，离心速度2 500 r/min,离心半径25 cm,离心15 min后，取上清后测定蛋白浓度进行电泳和转膜，然后用5% BSA封闭，分别加入相应抗体，4 ℃过夜，加入二抗孵育2 h，用ECL显影液暗室显影，仪器扫描拍照，以GAPDH作为内参进行分析。

1.6 免疫组化检测病理组织中p53蛋白的表达

取材后标本即以10%福尔马林固定48 h，石蜡包埋，5 μm连续切片备用。按照免疫组织化学试剂盒说明书进行操作：石蜡切片脱蜡，3% H2O2进行内源性过氧化物酶活性灭活，然后热修复，采用10%山羊血清进行封闭，加入一抗，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗3次，滴加二抗，孵育15 min，PBS冲洗，DAB显色，显微镜下拍照。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，定性资料采取例数(%)描述，组间比较采用2检验或Fisher确切概率法；定量资料采用均数±标准差描述，组间比较采用t检验。检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 两组血清中MMP-2和MMP-9含量比较

观察组血清中MMP-2含量为(47.65±9.46)ng/mL，MMP-9为(56.54±10.63)ng/mL，含量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 两组血清中MMP-2和MMP-9含量

2.2 两组MMP-2和MMP-9 mRNA转录水平比较

观察组中MMP-2和MMP-9的mRNA转录水平均高于对照组，差异有统计学意义(MMP-2：t=6.657，P=0.003；MMP-9：t=7.126，P=0.009)(图1)。

图1 两组血清中MMP-2和MMP-9转录水平比较

2.3 两组MMP-2和MMP-9蛋白表达比较

与对照组相比，观察组中MMP-2(0.817±0.032)和MMP-9(0.838±0.061)的蛋白表达高于对照组(MMP-2：0.087±0.011；MMP-9：0.093±0.028)，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图2 Western blot检测标本中MMP-2和MMP-9蛋白的表达

2.4 两组标本中MMP-2和MMP-9蛋白表达

免疫组化结果显示，褐色为阳性细胞，MMP-2和MMP-9在正常对照组仅见微量表达或不表达，而在观察组标本组织中可见MMP-2和MMP-9表达升高(图3)。

图3 免疫组化法检测标本中MMP-2和MMP-9蛋白的表达(400×)

3 讨论

MMPs主要由血管内皮细胞、单核细胞和平滑肌细胞产生，在体内能够参与很多生理过程，主要包括胚胎发育、血管生成、伤口愈合和神经细胞的发育。其中MMP-2的底物主要包括弹性蛋白、明胶和Ⅴ型胶原，而且MMP-2的表达异常与脑血管畸形密切相关[15-17]。MMP-9是一种促炎蛋白酶，又称Ⅳ型胶原酶，首先在体内以前体形式分泌，但没有活性，然后经过特殊的蛋白酶或自由基激活才能发挥作用，其底物主要包括明胶、Ⅳ型胶原和弹性蛋白等[18]。研究[19]发现MMP-9的高表达能够破坏血管内皮细胞外基质，这可能是促进畸形血管团生长的一个重要因素。

本研究结果显示，观察组患者MMP-2和MMP-9在血清中的水平均明显高于对照组，并且观察组中MMP-2和MMP-9在mRNA及蛋白表达水平上升高，免疫组化结果同样证明了观察组患者组织中MMP-2和MMP-9蛋白的表达率上升，即MMP-2 和 MMP-9 是调节细胞外基质动态平衡的明胶酶，其与颅内动脉瘤的发生和破裂关系密切。明胶酶MMP-2与MMP-9 对 ECM 具有破坏作用，其可降解构成 ECM 的主要组成成分，包括蛋白多糖、纤维连接蛋白和胶原，从而参与重建细胞外基质。MMP-2 和 MMP-9 的活性增加能够破坏动脉基底膜的组成部分-IV 型胶原，进而打破了动脉壁的平衡机制，诱发动脉壁发生退行性变。

综上所述，MMP-2和MMP-9在脑血管畸形的形成和发展中发挥重要作用，如果能够调节局部MMP-2和MMP-9的含量，这可能成为新的治疗脑血管畸形的方法。目前研究者能够在体外制备MMP-2和MMP-9的特异性抑制剂，而且应用这些特异性抑制剂能够抵抗MMP-2和MMP-9对细胞外基质的降解作用，MMP-2和MMP-9特异性抑制剂以后有可能成为治疗脑血管畸形的药物[20]。MMP-2和MMP-9既可作为脑血管畸形的诊断标志物，又可作为其治疗靶点，调节MMP-2和MMP-9的表达有可能成为治疗脑血管畸形新的方法。