冷暴露对高脂饮食小鼠脂肪棕色化的影响

程 龙，朱耀萱，周 晶，宁一博，张硕峰，孙建宁，董世芬

(北京中医药大学中药学院中药药理系，北京 102488)

肥胖以脂肪组织过度堆积和脂质代谢失调为特征，与多种代谢疾病的发生有关，如2型糖尿病、高脂血症、高血压、心血管疾病等，是全球面临的重要的公共卫生问题[1]。一项来自200个国家的1 920万人的实验研究表明，到2025年，全球男性肥胖患病率将达18%，女性患病率将超过21%[2]。

在哺乳动物中，脂肪组织主要以两种形式存在：白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪组织(brown adipose tissue，BAT)。WAT主要以甘油三酯的形式储存葡萄糖和脂肪酸中所含的能量，并以游离脂肪酸的形式释放能量；BAT含有大量线粒体，具有通过脂肪酸的氧化以热量的形式消散能量的能力。随着研究深入发现，人体内除了WAT和BAT外，还存在一种叫作“米色脂肪”的脂肪组织类型[3]。当机体交感神经兴奋时(如冷刺激、β3肾上腺素受体激活)，原本具有白色脂肪细胞特征的脂肪细胞高表达线粒体解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)蛋白，耗能增加，减少脂质在脂肪细胞中的堆积，具有类似经典的棕色脂肪细胞的功能，这个过程称为“脂肪棕色化”，同时研究证明皮下腹股沟白色脂肪比附睾脂肪更容易转化[4]。C57BL/6J小鼠喂食高脂饲料一段时间后，易出现白色脂肪细胞过度堆积及脂质代谢异常，是研究肥胖及相关代谢疾病的较佳模型[5]。因此，本研究以C57BL/6J小鼠为研究对象，观察冷暴露对肥胖模型小鼠脂肪棕色化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄♂SPF级C57BL/6J小鼠32只，体质量(20±2)g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供[SCXK(京)2016-0002]，合格证号：11401500032946。小鼠饲养于北京中医药大学屏障环境动物实验室[SYXK(京)2016-0038]，室温(25±2)℃、45%相对湿度，12 h/12 h光暗周期，饲养期间小鼠自由进食及饮水。本研究通过北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审批准许可，编号：BUCM-4-2018030701-2063。

1.2 试剂高脂饲料(D12492，5.24 kcal·g-1)、普通饲料(3.24 kcal·g-1)，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0008]；血糖试纸，购于强生(中国)医疗器材有限公司，批号为4334014；总胆固醇(total cholesterol，TC)测试盒、甘油三酯(triglyceride，TG)测试盒、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)测试盒、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)测试盒、游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)测试盒，均购于南京建成生物工程研究所，批号分别为20180816、20180816、20180810、20180814、20180817；瘦素(leptin peptide，LEP)、脂联素(adiponectin，ADPN)ELISA试剂盒，购于美国Cloud-Clone Corp，批号分别为L180809637、L180712071；UCP1、抗增殖蛋白(prohibitin，PHB)抗体，购于Abcam公司，批号分别为GR3188478-6、GR248742-21。

1.3 仪器全波长酶标仪BMG SPECTROstar Nano (江苏万科科教仪器有限公司)；血糖仪(强生医疗器材有限公司)；UH5300双光束分光光度计(日本日立公司)。

1.4 方法

1.4.1实验动物分组及造模 将32只8周龄♂SPF级C57BL/6J小鼠随机分为2组，即正常组、模型组，模型组小鼠喂食高脂饲料，正常组小鼠喂食普通饲料。干预8周后，将模型组、正常组小鼠各随机分为2组，即高脂5 ℃冷暴露(HFD+5 ℃)干预组、高脂室温(25±2)℃(HFD+RT)干预组、正常5 ℃冷暴露(Normal+5 ℃)干预组、正常室温(25±2)℃(Normal+RT)干预组，每天不同温度干预2 h，连续干预8周，每周监测小鼠体质量、体温、进食量。

1.4.2空腹血糖及口服葡萄糖耐受量的测定 连续冷暴露干预8周后，小鼠在禁食不禁水12 h后，采用剪尾取血的方法，用血糖仪试纸法测定小鼠血糖(blood glucose，BG)。用50%葡萄糖按2 g·kg-1剂量灌胃，测定灌胃前(0 min)及灌胃后30、60、90、120 min小鼠血糖，绘制糖耐量(oral glucose tolerance test，OGTT)时间曲线图，并采用近似梯形方法计算曲线下面积(area under curve，AUC)，计算公式如下：AUC=0.5 h[1/2(BG0 min+BG30 min)+1/2(BG30 min+BG60 min)+1/2(BG60 min+BG90 min)+1/2(BG90 min+BG120 min)][6]。

1.4.4取材 连续冷暴露干预8周后，禁食12 h，麻醉取血约1 mL，3 500 r·min-1离心10 min，分离血清。取血后，解剖分离皮下腹股沟白色脂肪及肩胛区棕色脂肪，并称重，皮下腹股沟白色脂肪及肩胛区棕色脂肪组织放在10%中性福尔马林固定液中固定。

1.4.5脂肪重量/体质量的测定 精确称重小鼠皮下腹股沟白色脂肪重量及肩胛部棕色脂肪重量，计算腹股沟白色脂肪重量(iWAT)/体质量(WB)、肩胛区棕色脂肪重量(BAT)/体质量(WB)的比值。

1.4.6血脂的检测 按照说明，采用生化试剂盒测定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA、LEP及ADPN的含量。

1.4.7脂肪组织HE染色 将固定在10%中性福尔马林固定液中的iWAT、BAT取出，石蜡包埋、切片后，常规HE染色，正置显微镜观察脂肪细胞形态学变化。

1.4.8脂肪组织免疫组织化学染色 将iWAT、BAT切片常规脱蜡、脱水；抗原修复；阻断内源性过氧化物酶；封闭；切片分别加UCP1、PHB一抗4 ℃过夜；过夜后，PBS清洗，滴加二抗；DAB显色；终止显色后，苏木精复染，流水返蓝；常规脱水、透明、中性树胶封片。棕黄色着色即为阳性细胞抗原存在位置。

1.4.9脂肪组织UCP1、PHB蛋白的表达 使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0，选取棕黄色处为阳性着色，对阳性表达处进行平均光密度(average optical density，AOD)分析。

2 结果

2.1 冷暴露对C57BL/6J小鼠体质量、进食量、体温及Lee’s指数的影响如Fig 1A所示，实验期间，各组小鼠体质量呈现增长趋势。与Normal+RT组比较，在整个冷暴露干预期间，HFD+5 ℃组、HFD+RT组小鼠体质量明显增加；在冷暴露第8周时，Normal+5 ℃组小鼠体质量明显降低；与HFD+RT组比较，在冷暴露第6周至实验结束，HFD+5 ℃组小鼠体质量明显降低。结果提示冷暴露可抑制高脂饲料喂养致体质量快速增长。如Fig 1B所示，与Normal+RT组比较，在整个实验期间，HFD+5 ℃组、HFD+RT组小鼠进食量明显增加；在冷暴露第4周至实验结束，Normal+5 ℃组小鼠进食量明显增加；与HFD+RT组比较，在冷暴露第2周至实验结束，HFD+5 ℃组小鼠进食量明显增加。结果显示冷暴露条件下，小鼠的进食量增加。如Fig 1C所示，在冷暴露干预下，Normal+RT、HFD+RT、Normal+5 ℃、HFD+5 ℃四组小鼠体温差异无显著性，提示冷暴露对小鼠核心体温基本无影响。如Fig 1D所示，与Normal+RT组比较，HFD+5 ℃组、HFD+RT组小鼠Lee’s指数明显增加；Normal+5 ℃组小鼠Lee’s指数差异无显著性；与HFD+RT组比较，HFD+5 ℃组小鼠Lee’s指数有降低趋势，但差异无显著性。结果提示冷暴露对降低小鼠Lee’s指数无明显作用。

2.2 冷暴露对C57BL/6J小鼠脂肪重量与体质量比值的影响如Fig 2A所示，与Normal+RT组比较，HFD+5 ℃组、HFD+RT组小鼠iWAT重量/体质量的比值明显增加，Normal+5 ℃组小鼠明显降低；与HFD+RT组比较，HFD+5 ℃组小鼠iWAT重量/体质量的比值明显降低。如Fig 2B所示，与Normal+RT组比较，HFD+RT组小鼠BAT重量/体质量的比值明显降低，HFD+5 ℃、Normal+5 ℃组小鼠BAT重量差异无显著性；与HFD+RT组比较，HFD+5 ℃组小鼠BAT重量/体质量的比值明显增加。上述结果提示，冷暴露具有降低高脂饮食小鼠iWAT重量/体质量比值的作用，增加其BAT重量/体质量的比值。

2.3 冷暴露对C57BL/6J小鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐受量及AUC的影响Fig 3A口服葡萄糖耐受量结果显示，与Normal+RT组比较，在第0 min时，HFD+RT组小鼠空腹血糖明显升高；HFD+ 5℃、Normal+5 ℃组小鼠血糖差异无显著性；与HFD+RT组比较，在第0 min时，HFD+5 ℃组小鼠空腹血糖明显降低。在用50%葡萄糖按2 g·kg-1剂量灌胃30 min后，与Normal+RT组比较，HFD+5 ℃组、HFD+RT组小鼠血糖明显升高；与HFD+RT组比较，灌胃30 min后，HFD+5 ℃组小鼠血糖差异无显著性。从灌胃后60 min至实验结束，与Normal+RT组比较，HFD+5 ℃组、HFD+RT组小鼠血糖明显升高；与HFD+RT组比较，从灌胃后60 min至实验结束，HFD+5 ℃组小鼠空腹血糖明显降低。如Fig 3B所示，与Normal+RT组比较，HFD+5 ℃ 组、HFD+RT组小鼠AUC明显升高；Normal+5 ℃组小鼠AUC差异无显著性；与HFD+RT组比较，HFD+5 ℃组小鼠AUC明显降低。上述结果提示冷暴露能改善其葡萄糖耐受量。

Fig 1 Effect of cold exposure on body weight, food intake, body temperature and Lee’s index in C57BL/6J

*P<0.05,**P<0.01vsNormal+RT group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+RT group

Tab 1 Effect of cold exposure on TC, TG, LDL-C and HDL-C in blood lipids of C57BL/6J

*P<0.05,**P<0.01vsNormal+RT group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+RT group

Fig 2 Effect of cold exposure on adipose tissue weight to body weight ratio in C57BL/6J

*P<0.05,**P<0.01vsNormal+RT group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+RT group

2.4 冷暴露对C57BL/6J小鼠血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C的影响如Tab 1所示，与Normal+RT组比较，HFD+5 ℃组、HFD+RT组小鼠血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C含量明显升高；Normal+5 ℃组小鼠清中TC、TG、LDL-C含量明显降低，HDL-C含量差异无显著性；与HFD+RT组比较，HFD+5 ℃组小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量明显降低，HDL-C含量差异无显著性。结果显示，冷暴露能降低高脂饮食小鼠血脂水平。

Fig 3 Effect of cold exposure on blood glucose, oral glucose tolerance, and AUC in C57BL/6J

*P<0.05,**P<0.01vsNormal+RT group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+RT group

2.5 冷暴露对C57BL/6J小鼠血脂中FFA、LEP及ADPN的影响如Tab 2所示，与Normal+RT组比较，HFD+5 ℃组、HFD+RT组小鼠血清中FFA、LEP含量明显升高，ADPN含量明显降低；Normal+5 ℃组小鼠血清中FFA、LEP含量明显降低，ADPN含量明显升高；与HFD+RT组比较，HFD+5 ℃组小鼠血清中LEP含量明显降低，FFA含量有降低趋势，ADPN含量有增加趋势，但差异均无显著性，提示冷暴露能降低高脂饮食小鼠血清中LEP水平。

Tab 2 Effect of cold exposure on FFA, LEP and ADPN in blood lipids of C57BL/6J

*P<0.05,**P<0.01vsNormal+RT group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+RT group

2.6 冷暴露对C57BL/6J小鼠iWAT、BAT形态的影响Fig 4为iWAT、BAT的HE染色结果，在iWAT中，Normal+RT组小鼠呈现出较大空泡状，形状近似圆形，组织比较致密；HFD+RT组小鼠呈现出大空泡的脂肪室，且形状不规则，细胞核、细胞器及胞质被挤到一侧呈薄环，白色脂肪特征明显；与HFD+RT组相比，Normal+5 ℃组、HFD+5 ℃组小鼠皮下腹股沟白色脂肪细胞出现多室，细胞变小、变圆，组织变的更加致密，具有棕色化趋势。在BAT中，Normal+RT组小鼠呈现近圆形的、小的脂肪室，脂肪细胞周围具有丰富的毛细血管；HFD+RT组小鼠呈现出较大的、单个空泡脂肪室，具有棕色细胞白色化的趋势；与HFD+RT组相比，Normal+5 ℃组、HFD+5 ℃组小鼠BAT细胞变小、变圆，分布明显增多且出现多室，细胞间毛细血管更加丰富。

2.7 冷暴露对C57BL/6J小鼠iWAT、BAT部位UCP1蛋白表达的影响UCP1蛋白具有解偶联作用，阻止ADP生成ATP，增加产热，是BAT中标志性蛋白。如Fig 5所示，在iWAT中，Normal+RT组可见少量的UCP1阳性细胞表达；HFD+RT组UCP1阳性细胞表达明显减少，与Normal+RT组比较差异有显著性；与HFD+RT组比较，Normal+5 ℃ 组、HFD+5 ℃组UCP1阳性细胞表达明显增多。在BAT中，Normal+RT组可见较多的UCP1阳性细胞表达；HFD+RT组UCP1阳性细胞表达明显减少，与Normal+RT组比较差异有显著性；与HFD+RT组比较，Normal+5 ℃组、HFD+5 ℃组UCP1阳性细胞表达明显增多。上述结果显示，冷暴露能增加高脂饮食小鼠iWAT、BAT中UCP1蛋白表达，具有激活BAT功能及促进脂肪棕色化的作用。

2.8 冷暴露对C57BL/6J小鼠iWAT、BAT部位PHB蛋白表达的影响PHB蛋白主要存在于线粒体内膜上，在维持线粒体形态和功能及调节能量代谢中发挥着重要作用。如Fig 6所示，在iWAT中，Normal+RT组、HFD+RT组可见极少量的PHB阳性细胞表达，两者比较差异无显著性；与HFD+RT组比较，Normal+5 ℃组、HFD+5 ℃组PHB阳性细胞表达明显增多。在BAT中，Normal+RT组可见较多的PHB阳性细胞表达；HFD+RT组PHB阳性细胞表达减少，但与Normal+RT组比较，差异无显著性；与HFD+RT组比较，Normal+5 ℃组、HFD+5 ℃组PHB阳性细胞表达明显增多。上述结果提示，冷暴露能增加PHB蛋白在iWAT、BAT中的表达。

Fig 4 Effect of cold exposure on morphology in iWAT and BAT in C57BL/6J mice(×400)

Fig5EffectofcoldexposureonexpressionofUCP1proteininiWATandBATofC57BL/6Jmice(×400)

A: UCP1 protein was expressed in situ in iWAT and BAT; B: AOD of UCP1 protein in iWAT and BAT.*P<0.05,**P<0.01vsNormal+RT group;##P<0.01vsHFD+RT group.

Fig6EffectofcoldexposureonexpressionofPHBproteininiWATandBATofC57BL/6Jmice(×400)

A: PHB protein was expressed in situ in iWAT and BAT; B: AOD of PHB protein in iWAT and BAT.**P<0.01vsNormal+RT group;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+RT group.

3 讨论

脂肪组织是主要的代谢器官，在能量稳态中起关键作用。基于细胞形态和组织功能，哺乳动物的脂肪组织分为WAT和BAT两种类型。WAT不仅是能量储存的器官，同时也是功能活跃的内分泌器官，其分泌的蛋白质或脂肪细胞因子影响机体的糖脂代谢平衡、血压水平、炎症反应等，与血瘀证包括高血糖、高血压、高脂血症、动脉粥样硬化等的发生、发展密切相关。BAT在适应寒冷环境和能量消耗的调节中起重要作用，是哺乳动物非颤栗性产热的主要来源。非颤栗性产热的激活主要依赖BAT中的UCP1蛋白解偶联驱动[8]。UCP1在棕色脂肪线粒体中特异性表达，并且负责BAT的独特代谢功能，其通过线粒体内膜消散质子梯度，从而使电子传递系统与三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成解偶联，使能量以热量的形式消散[9]。

研究发现，在禁食和正常室温条件下，BAT功能与WAT代谢活性相当，当机体的交感神经兴奋时(如冷刺激)，BAT的功能激活及iWAT中UCP1表达明显增加，出现BAT的典型特征，增加耗能及产热[10]。PHB主要定位于线粒体内膜，少量存在于细胞核、细胞膜及胞质中，在维持线粒体形态、功能及调节能量代谢方面有着重要作用[11]。本研究结果显示，冷刺激明显降低高脂饮食小鼠体质量、iWAT重量/体质量比值，同时增加BAT重量/体质量比值，脂肪组织HE染色发现，与HFD+RT组相比，冷暴露干预组小鼠iWAT细胞出现多室、变小、变圆等类似棕色脂肪细胞表型，BAT明显增多且出现多室，细胞间毛细血管更加丰富；免疫组化结果显示，冷暴露可明显增加UCP1、PHB在iWAT和BAT中的表达。Schreiber等[12]研究证实，在冷刺激条件下，野生型小鼠通过增加摄食维持核心体温恒定。本实验结果显示，各组小鼠间核心温度无明显改变，与上述实验报道一致。

冷暴露激活的BAT和iWAT显示有调控血中TG水平的作用，其主要依赖脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)的活性和跨膜受体CD36，增加其对富甘油三酯脂蛋白(triglyceride-rich lipoprotein，TRL)的摄取，进而加速清除血清中TG，改善高脂血症[13]。本研究结果显示，冷刺激明显降低小鼠血清中TC、TG、LDL-C及FFA含量，可能与激活BAT及诱导iWAT棕色化有关。OGTT实验结果显示，冷暴露明显降低高脂饮食小鼠空腹血糖及改善葡萄糖耐量，可能与冷暴露增加棕色化和棕色脂肪对血中葡萄糖的摄取有关。已有报道证实，瘦素具有维持机体能量代谢和调节脂肪比例的功能，其作用于下丘脑神经肽(neuropeptide Y，NPY)/刺鼠肽基因相关蛋白(agouti-related peptide，AgRP)，抑制食欲及促进能量消耗，也可与胰岛素协同作用于下丘脑的阿片-促黑素细胞皮质素原(proopiomelanocortin，POMC)神经元，使POMC神经元参与到脂肪棕色化过程中，增加耗能[14]。本研究结果显示，冷暴露明显降低高脂饮食小鼠血清中瘦素含量，增加其进食量，其机制可能与瘦素的双向调节有关。脂联素是一种脂肪组织分泌的内源性胰岛素增敏剂，具有增加胰岛素的敏感性及促进外周组织脂肪酸氧化的作用，其水平的降低是高脂血症和糖尿病的独立危险因素[15]。本研究结果显示，与室温高脂饮食组相比，高脂冷暴露组小鼠血清中脂联素含量有升高的趋势，但差异无显著性。

综上所述，冷暴露可明显抑制高脂饮食小鼠体质量增长，改善口服葡萄糖耐受量，降低iWAT重量/体质量比值、血清中TC、TG、LDL-C及瘦素含量，同时增加进食量、BAT重量/体质量比值及iWAT和BAT中UCP1、PHB蛋白表达，激活棕色脂肪组织及诱导脂肪棕色化，增加产热，减少白色脂肪堆积，在研究肥胖相关疾病时具有重要意义。