microRNA-373过表达可促进乳腺癌侵袭转移

丛竹军 张海俊 李 漪

(新疆石河子大学医学院第一附属医院普外二科，石河子 832008)

乳腺癌发病率约为29%，列女性恶性肿瘤第一位，死亡率为14%，居女性恶性肿瘤的第一位，严重威胁女性患者的生命安全和生活质量[1]。研究显示，乳腺癌转移是其主要死因，探究乳腺癌的分子生物学、遗传学、病因和细胞起源等在改进治疗方案和鉴别预后等方面发挥重要作用[2]。miRNA是内源性非编码蛋白质的单链RNA，可从转录后水平调控基因的表达，异常表达涉及肿瘤的生长、侵袭、凋亡、侵袭等过程[3,4]。近年来的研究显示，miRNA-373与胃癌、肺癌发生和进展有关，但在乳腺癌中研究较少[5]。本研究通过人工化学合成的miRNA-373拟似物和阻遏物转染乳腺癌MCF-7细胞，探讨miRNA-373对乳腺癌MCF-7细胞侵袭的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株与动物 乳腺癌MCF-7购自上海中科院细胞库；细胞培养条件：10%胎牛血清，100 U/ml青霉素钠和100 mg/ml链霉素的RPMI1640培养基，含5%CO2的37℃恒温箱中孵育。4～6周龄BALB/c无胸腺雌性裸鼠12只，购自山东大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(鲁)2017-102，动物使用许可证号：SYXK(鲁)2017-131。

1.1.2主要仪器和试剂 胎牛血清购自上海慧颖生物科技有限公司，0.25%胰蛋白酶购自上海千曦生物科技有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂、Trizol和反转录试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；Transwell小室购自北京雅安达生物技术有限公司；细胞培养箱购自上海杰涵实验设备有限公司；RT-PCR试剂盒购自深圳市康百得生物科技有限公司；分光光度计、酶标仪、PCR仪购自上海谱元仪器有限公司；miRNA-373拟似物、阻遏物、阴性对照物合成与测序均由宝生物工程(大连)有限公司。

1.2方法

1.2.1裸鼠移植瘤模型建立 MCF-7细胞8×106悬浮于磷酸盐溶缓冲液中，取200 μl接种于裸鼠腋窝皮下，肿瘤平均体积达到100～200 mm3时进行观察。

1.2.2细胞转染 取对数生长期的MCF-7细胞，胰酶消化后1 000 g离心2 min，收集细胞，调整细胞密度至1×105个/ml，接种至6孔细胞培养板，每孔添加2 ml细胞悬液，37℃ 5%CO2条件下培养 24 h，共分为4组，即空白对照组(Blank control group，BC组)只转染试剂，阴性对照组(Negative control group，NC组)转染miRN-373阴性对照物，miRNA-373拟似物转染组(Mimetic transfection group，MT组)转染miRNA-373拟似物，miRNA-373阻遏物转染组(Repressor transfection group，RT组)转染miRNA-373阻遏物，转染过程按照Lipofectamine 2000说明进行。

1.2.3转染后MCF-7细胞miRNA-373表达检测 转染后48 h，采用6孔板接种密度2×105个/孔，酚氟仿法抽取RNA，取2 μg总RNA，反转录制备cDNA，取2 μl反转录产物作为PCR反应模板，荧光定量法检测miRNA-373含量。引物序列：miRNA-373，上游：5′-GTAGCAGGATGGCCCTAGAC-3′，下游：5′-CGCCCTCTGAACCTTCTCTT-3′；内参(RNU6-B)，上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGC-3′。

1.2.4转染后MCF-7细胞侵袭能力检测 取转染后HCF-7细胞1×105ml-1，接种于Transwell板上室，每孔160 μl，加入20%ASPS血清40 μl，800 μl RMPI1640培养基加入下室，培养24 h，计数基底膜下室细胞数，采用在×400显微镜下随机选取中央和上下左右5个视野的穿越基底膜细胞数，取均值。

1.2.5癌组织miRNA-373表达 取12只裸鼠的癌组织和癌旁组织，Trizol法抽提总RNA并进行纯化，采用qRT-PCR法检测癌组织和癌旁组织中miRNA-373的表达。

2 结果

2.1癌组织和癌旁组织miRNA-373表达比较 qRT-PCR检测显示，乳腺癌组织miRNA-373表达显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2转染后MCF-7细胞miRNA-373表达比较 qRT-PCR检测显示，转染后BC组和NC组miRNA-373表达差异无统计学意义(P<0.05)，MT组miRNA-373表达显著高于BC组、NC组和RT组(P<0.05)，RT组miRNA-373表达显著低于BC组、NC组和MT组(P<0.05)。见图2。

图1 癌组织和癌旁组织miRNA-373表达比较Fig.1 Comparison of miRNA-373 expression in cancer tissues and adjacent tissues

图2 转染后MCF-7细胞miRNA-373表达比较Fig.2 Comparison of miRNA-373 expression in MCF-7 cells after transfection

图3 转染后MCF-7细胞穿膜细胞数比较Fig.3 Comparison of transmembrane cells′ number in MCF-7 cells after transfection

2.3转染后MCF-7细胞穿膜细胞数比较 MT组穿膜细胞数显著低于BC组、NC组和RT组，RT组穿膜细胞数显著高于BC组、NC组和MT组，差异均有统计学意义(P<0.05)；BC组和NC组穿膜细胞数相比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

3 讨论

Yang等[6]及Huang等[7]研究均显示，低表达的miRNA-373可通过上调靶基因提高肿瘤细胞增殖能力，促进细胞的生长和侵袭。Wang等[8]研究显示，靶向下调miRNA-373表达可诱导宫颈癌细胞增殖。曲蕴慧等[9]研究显示，microRNA-373可介导Bcl-6抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。武卫华等[10]研究则显示，通过转染方式表达microRNA可增加钙黏蛋白表达，降低体外培养的人腹腺癌A549细胞的迁移能力。以上结果初步揭示了miRNA-373表达在恶性肿瘤的增殖侵袭过程中发挥重要作用。

本研究首先通过建立裸鼠MCF-7移植模型，探讨了miRNA-373在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达情况，结果显示癌组织miRNA-373表达显著低于癌旁组织，提示miRNA-373在乳腺癌组织中低表达。本研究同时通过脂质体转染法转染miRNA-373拟似物和阻遏物至乳腺癌MCF-7细胞，RT-PCR检测结果显示拟似物转染组MCF-7细胞miRNA-373表达显著高于空白对照组和阴性对照组，阻遏物转染组MCF-7细胞miRNA-373表达显著低于空白对照组和阴性对照组，Transwell小室研究显示，拟似物转染组穿膜细胞数显著低于空白对照组和阴性对照组，阻遏物转染组穿膜细胞数显著高于空白对照组和阴性对照组，结果提示，乳腺癌MCF-7细胞的侵袭和迁移能力受miR-373调控，增强miRNA-373可降低MCF-7细胞侵袭和迁移能力，为乳腺癌治疗的新基因靶点药物的开发提供了思路。