土壤酸化对景天三七叶片光合特性及超微结构的影响

王一鸣，龙胜举，陈 延，贺忠群，*，赵英鹏，仰路希，严文一

(1.四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130； 2.四川省内江市农业科学院，四川 内江 641000)

土壤酸化在自然界中普遍存在[1]，例如：大气环境污染导致的酸沉降增加[2]、农业上铵态氮肥等化学肥料的不当施用[3]、农作物收获后导致土壤中钙、镁、钾等盐基养分的减少等[4]。土壤酸化不仅会破坏土壤结构[5]，导致矿质营养元素的流失和重金属的活化[6]，还会抑制土壤微生物活性[7]，从而影响作物对于土壤中营养元素的吸收利用。同时土壤酸化还会释放出大量的活性铝离子[8]，对根系的生长产生抑制[9]，破坏细胞形态和结构的完整性[10]，破坏叶绿体被膜结构导致叶绿素含量降低，使光合作用在一定程度上受到抑制[11]，从而降低作物的产量及品质。中国酸化土壤总面积高达2.04×108hm2，约占全国土壤面积的22.7%，超过40%的耕地出现不同程度的酸化[12]，因此土壤酸化已经成为了严重制约中国粮食安全、农田和农业可持续发展的因素之一。

景天三七(SedumaizoonL.)又名费菜，景天科景天属多年生草本植物，是一种从传统繁育中筛选出来的野生蔬菜，富含三萜、甾醇、黄酮类等活性物质[13]，具有保护心脑血管、促进血液循环、增强免疫力等保健功效[14]，目前已经成为具有较高经济价值的绿色保健野生蔬菜[15]。景天三七在生产栽培中表现出了极强的抗逆性，但在生理逆境方面的研究较少。随着景天三七栽培面积的越来越广泛以及中国可耕地土壤酸化面积的逐步增加，研究土壤酸化对景天三七叶片光合及超微结构的影响，可为景天三七在酸化土壤中的生产栽培提供一定的理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

土壤来自四川农业大学，pH 6.6，速效氮53.6 mg·kg-1，速效磷44.1 mg·kg-1，速效钾176.7 mg·kg-1，有机质10.2 mg·kg-1。

植物为景天三七(SedumaizoonL.)，由四川农业大学园艺学院提供。所有景天三七材料于5月中旬插繁殖20 d后得到。

1.2 实验方法

将土壤风干过2 mm孔径筛，取出部分土壤用稀释后的浓硫酸预调酸，保湿并静置7 d后，再次风干土壤测定pH，绘制土壤pH变化曲线，并计算出土壤调酸公式。根据得到的调酸公式对土壤进行调酸，得到土壤pH 3.4(重度)、pH 4.6(中度)、pH 5.5(轻度)、pH 6.6(CK)4个梯度的土壤，然后将株高4 cm的景天三七移栽到装好不同土壤pH的营养钵(12 cm×13 cm)中培养，每个营养钵移栽1株并加入300 g该处理土壤，每个处理8盆每盆1株，重复3次，共96盆96株景天三七。将植株置于通风良好的塑料大棚中进行常规栽培，每个营养钵下放置托盘，在浇水的过程中做到少量多次，用土壤三参数仪测定土壤含水量，使其保持在75%左右，以使土壤pH保持稳定，在28 d时测定相关的指标。

1.3 指标测定方法

1.3.1 土壤pH及铝离子含量的测定

土壤pH的测定参考鲁如坤[16]的方法；土壤中铝离子含量测定使用百灵达便携式土壤养分测定仪SKW500测定。

1.3.2 生理生化指标的测定

叶片相对电导率的测定参考王学奎[17]的方法；叶片可溶性糖含量的测定参考熊庆娥[18]的方法；叶片可溶性蛋白的测定参考熊庆娥[18]的考马斯亮兰G-250染色法；叶片丙二醛(MDA)含量的测定参考熊庆娥[18]的硫代巴比妥酸法；叶片游离脯氨酸含量的测定参考熊庆娥[18]的茚三酮比色法；叶绿素含量的测定采用直接浸提法[19]。

SOD活性的测定参考李合生[20]的方法；CAT活性的测定参考李忠光等[21]的方法；APX活性的测定参考Nakano等[22]的方法；GR活性的测定参照Ma等[23]的方法。

1.3.3 光合参数和叶绿素荧光参数测定

胁迫28 d时，在早上10:00采用透明叶室测定自然光照下的光合参数(光照强度为21 383 lx)，测定选取景天三七中上部生长健壮的成熟叶片，利用英国PPS公司生产的CIRAS-2型光合测定仪进行测定[24]。

用暗适应叶夹叶片30 min后，用PAM-2500荧光仪(Walz，Effeltrich，Germany)测定叶绿素荧光参数，Meas. Ligth int.设置为4档，Act. Ligtht int.设置为9档，Sat. Pulse int.设置为10档，Slow Induction中Delay设置为40 s，Clock设置为20 s，Width设置为210 s，测定方法参照Cuddy等[25]。

1.3.4 叶片超显微结构的观察

景天三七生长28 d后，取上部叶片和根尖，送四川大学电镜室，采用透射电镜观察其超微结构变化。

1.4 数据分析

用Excel 2016对实验数据进行统计分析，用SPSS 22软件对数据进行方差分析，对有显著差异(P<0.05)的处理采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 土壤酸化对土壤中铝离子含量、叶片细胞相对电导率和丙二醛含量的影响

由表1可知，土壤中铝离子含量、叶片细胞相对电导率和丙二醛含量随着土壤酸化程度加深而迅速升高，在pH 4.6和pH 3.4的土壤中铝离子含量分别是CK的43倍和120倍，但在pH 5.5轻度酸化情况下则与CK无显著差异。

2.2 土壤酸化对景天三七叶光合特性的影响

总叶绿素含量随着土壤酸化程度的加深而逐渐降低，但对轻度和中度酸化下的光合参数没有显著影响；而在重度酸化下，光合速率、胞间CO2浓度、蒸腾速率、气孔导度则比CK显著降低了70.6%、67.1%、77.4%、80.5%，气孔限制值显著升高64.7%(表2)。

植株的荧光参数在轻度和中度酸化下与CK相比没有显著差异，但在重度酸化下，初始荧光Fo、最大荧光Fm、光化学效率ΦPSⅡ、光化学淬灭qP、光系统Ⅱ最大光合效率Fv/Fm迅速降低，非光化学淬灭NPQ则显著升高(表3)。

表1 土壤酸化对景天三七叶片相对电导率、丙二醛和土壤中铝离子含量的影响

Table1Effect of soil acidification on relative conductivity and the content of MDA ofSedumaizoonL. leaves and aluminum ions in soil

处理Treatment铝离子含量Aluminum ions content/(mg·kg-1)相对电导率Relative conductivity/%丙二醛MDA content/(μmol·g-1)pH 3.464.01±3.17 a32.67±1.53 a0.24±0.05 apH 4.622.92±2.16 b28.33±1.89 b0.17±0.01 bpH 5.50.78±0.06 c25.00±1.73 c0.13±0.01 cpH 6.60.53±0.03 c24.33±2.52 c0.14±0.01 c

同列不同行处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

The values in the same column without the same lowercase letters showed the significant difference(P<0.05). The same as below.

表2 土壤酸化对景天三七叶叶绿素含量及光合参数的影响

Table2Effect of soil acidification on chlorophyll content and photosynthetic parameters inSedumaizoonL.

处理Treatment净光合速率Pn/(μmol·m-2·s-1)胞间CO2浓度Ci/(μmol·mol-1)蒸腾速率Tr/(mmol·m-2·s-1)气孔导度Gs/(mol·m-2·s-1)气孔限制值Ls总叶绿素含量Total chlorophyllcontent/(mg·g-1)pH 3.42.82±0.76 b65.57±24.72 b0.45±0.19 b0.015±0.001 b0.84±0.11 a1.30±0.06 cpH 4.68.51±0.63 a173.83±12.64 a2.08±0.09 a0.081±0.001 a0.58±0.05 b1.61±0.09 bpH 5.59.09±1.25 a187.20±24.57 a2.11±0.31 a0.077±0.011 a0.52±0.06 b1.81±0.08 bpH 6.69.58±0.80 a199.08±25.91 a1.99±0.19 a0.077±0.001 a0.51±0.04 b2.28±0.13 a

表3 土壤酸化对景天三七叶片荧光参数的影响

Table3Effect of soil acidification on leaf fluorescence parameters inSedumaizoonL.

处理Treatment初始荧光Fo最大荧光Fm光系统Ⅱ实际光化学效率ΦPSⅡ光化学淬灭qP非光化学淬灭NPQ光系统Ⅱ最大光合效率Fv/FmpH 3.40.424±0.011 b1.64±0.08 b0.236±0.015 b0.429±0.099 b1.12±0.25 a0.741±0.012 bpH 4.60.497±0.030 a2.25±0.14 a0.505±0.036 a0.724±0.027 a0.51±0.15 b0.779±0.013 apH 5.50.500±0.019 a2.35±0.06 a0.513±0.039 a0.740±0.052 a0.70±0.08 b0.787±0.008 apH 6.60.488±0.016 a2.32±0.15 a0.472±0.016 a0.698±0.075 a0.61±0.11 b0.789±0.021 a

2.3 土壤酸化对景天三七叶片超显微结构的影响

由图1可以看出，在CK、轻度和中度酸化下，叶绿体沿细胞膜均匀分布，呈椭圆形，内外膜结构完整，基粒片层结构规则有序，平行排列，没有出现明显变形或片层之间出现明显间隙，嗜锇颗粒体积都相对较小，但数量相对较多；而在重度酸化下，叶绿体宽度增加并脱离细胞膜，在细胞质中扎堆分布，发生不同程度的肿胀变形，外背膜出现模糊的现象，基粒所占体积变小，片层间出现明显间隙，类囊体间出现扭曲或者变形，部分类囊体膜糊不清，嗜锇颗粒明显增大，但数量相对减少。CK中叶绿体内淀粉粒含量较少且体积较小；轻度和中度酸化下，淀粉粒则大小不一，但在叶绿体内均有分布；重度酸化下，淀粉粒大量增加且体积较大，占据了叶绿体接近一半或四分之三容积。

a，叶绿体；b，淀粉粒；c，嗜锇颗粒；d，基粒片层；e，线粒体；f，叶绿体紧贴细胞膜；g，细胞间隙。a， Chloroplast；b， Starch granule；c， Osmiophilic particles；d， Grana lamella；e， Mitochondria；f， Chloroplast was close to the cell membrane；g， Intercellular.图1 土壤酸胁迫对景天三七叶片超微结构的影响Fig.1 Effects of soil acidification on ultrastructure of Sedum aizoon L. leaves

2.4 土壤酸化对植株叶片渗透调节和抗氧化酶活性的影响

在轻度酸化下，叶片内可溶性糖含量比CK显著升高26%，其他渗透调节指标与CK无显著差异。随着土壤酸化程度的加剧，可溶性蛋白、游离脯氨酸含量显著增加，叶片可溶性糖含量则迅速降低(表4)。

SOD、CAT、APX、GR等抗氧化酶活性随着土壤酸化程度加深而迅速升高，但在轻度酸化下，除CAT活性比CK显著增高12.3%外，其他抗氧化酶活性与CK则无显著差异(表5)。

表4 土壤酸化对景天三七叶片渗透调节的影响

Table4Effect of soil acidification on leaf osmotic regulation inSedumaizoonL.

处理Treatment可溶性糖Soluble sugar content/(μg·g-1)可溶性蛋白Soluble protein content/(mg·g-1)游离脯氨酸Free proline content/(μg·g-1)pH 3.472.09±7.44 c1.65±0.03 a147.58±11.25 apH 4.675.36±7.88 c1.32±0.36 b120.94±7.83 bpH 5.5155.61±10.70 a0.72±0.09 c102.01±1.23 cpH 6.6115.52±5.32 b0.73±0.16 c98.38±8.91 c

表5 土壤酸化对景天三七叶片抗氧化酶活性的影响

Table5Effect of soil acidification on leaf antioxidant enzyme activity inSedumaizoonL.

处理Treatment超氧化物歧化酶SOD/(U·g-1)过氧化物酶CAT/(U·g-1)抗坏血酸过氧化物酶APX/(U·g-1)谷胱甘肽还原酶GR/(U·g-1)pH 3.4512.40±14.41 a289.65±11.70 a71.57±8.43 a22.79±2.58 apH 4.6439.64±18.55 b272.08±7.98 a52.92±4.56 b15.23±3.42 bpH 5.5355.96±20.00 c210.01±14.77 b39.83±6.23 c9.43±1.49 cpH 6.6339.79±15.05 c187.08±6.47 c34.09±2.08 c9.16±2.06 c

3 讨论

有研究表明，铝离子作为潜性酸的主要交换来源，土壤中铝离子含量的增加是土壤酸化的结果，不是其酸化的原因[28]。本实验进行土壤调酸后测定铝离子含量发现在土壤pH低于4.6以后铝离子溶出量急剧增加，实验结果与Rosenberg等[26]相似。丙二醛(MDA)和细胞相对电导率的变化可以反映出细胞膜脂的过氧化程度以及质膜透性变化所导致的电解质外渗情况[27]，在中度和重度酸化下，植株丙二醛(MDA)含量和细胞相对电导率显著增加，表明在一定铝离子浓度的作用下植株细胞膜脂受到了不同程度的氧化作用，其中重度酸化强于中度酸化。

植物的渗透调节、抗氧化酶活性变化以及膜脂过氧化作用已广泛用于对植物逆境反应机制的研究。可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸等渗透调节物质在逆境胁迫下调节细胞内外渗透势及维持细胞内相关代谢功能的正常进行发挥着重要的作用[28]。SOD、CAT、APX、GR等抗氧化酶在平衡细胞内产生活性氧自由基及清除上是植株体内不可缺少的酶类。实验结果表明，随着土壤酸化程度加剧，除了可溶性糖含量呈现出先上升后下降的趋势外，其他的渗透调节物质含量以及抗氧化酶活性均不断增加以保护或减轻细胞膜脂受到的过氧化作用，维持细胞内外渗透调节的平衡，特别是中度和重度酸化下的可溶性蛋白、游离脯氨酸和抗氧化酶活性显著高于CK，表明在土壤pH低于4.6以后，土壤酸胁迫会导致景天三七叶片细胞的膜质过氧化，并对细胞的正常生理代谢造成影响。

通过对叶绿素含量、光合及荧光参数的测定发现，虽然土壤酸化导致叶片内叶绿素含量的降低，但在轻度和中度酸化条件下植株光合作用能正常进行。只有当土壤pH低于4.6达到重度酸化后，Pn、Gs、Ci、Tr、Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、Fm才迅速降低，Ls、NPQ则显著升高。这表明重度酸化导致光系统Ⅱ反应中心遭到破坏或可逆失活，光合电子传递活性受到抑制，植株光合能力遭到严重抑制，这与井大炜等[29]的结果相似。

而对叶片的超显微结构进行观察发现，在CK、轻度和中度酸化下，叶绿体沿细胞膜均匀分布，结构完整，基粒片层结构规则有序，以利于最大程度接受光能进行光合作用；而在重度酸化下，叶绿体不再沿着细胞膜均匀分布，并在细胞质中扎堆聚集，并且叶绿体外背膜出现模糊，基粒片层间出现明显间隙，部分类囊体变得膜糊不清，这可能是无法及时清除的活性氧自由基对叶绿体的结构和功能造成了严重破坏。综上所述，为保证景天三七光合代谢的正常进行以及叶绿体结构和功能的完整，植株栽培的土壤pH不应低于4.6。