SERCA2表达对哮喘大鼠气道平滑肌细胞分泌IL-8的影响

俞珍惜 沈剑 黄先玫 李小莉 刘占利 蒋春明

气道平滑肌细胞（ASMCs）在哮喘的病理生理过程中发挥着重要作用，其生理功能受到细胞内Ca2+浓度（[Ca2+] i）的影响，[Ca2+] i的变化与哮喘气道高反应性（AHR）有关[1]。肌浆/内质网 Ca2+-ATP 酶（SERCA）介导的肌浆网（SR）钙摄取储存是调控[Ca2+] i稳定的重要机制，SERCA活性下降所导致的SR钙摄取储存功能受损可能显著影响钙依赖的平滑肌功能[2]。哺乳动物3个SERCA家族成员中的SERCA2在平滑肌中高度表达[3]。IL－8作为CXC趋化因子家族的一员，可趋化中性粒细胞、单核细胞及嗜酸性粒细胞向炎症、损伤及感染部位迁移，引发呼吸爆发，超氧负离子和过氧化氢释放。Digiovine等[4]证实在移植后闭塞性细支气管炎患者中，ASMCs是IL－8的最重要来源。但目前导致ASMCs分泌IL－8异常的机制仍未探明。

Pang等[5]发现缓激肽（BK）以浓度和时间依赖的方式增强ASMCs的IL－8释放，由于BK是SERCA2的抑制剂，本实验假设哮喘ASMCs中IL－8分泌亢进可能与SERCA2表达减少有关，通过从正常大鼠和经卵清蛋白（OVA）诱导的哮喘大鼠分离原代ASMCs，检测SERCA2表达、[Ca2+] i和IL－8水平，并利用siRNA技术下调SERCA2，探讨哮喘ASMCs中SERCA2表达与IL－8分泌的关系，旨在为研究哮喘ASMCs的细胞炎症机制提供一定的实验依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及材料 SPF级SD雄性大鼠30只，体重120～160g，6～8周龄，由上海斯莱克实验动物中心提供。主要材料试剂如下：OVA、BK、吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）及毒胡萝卜素（TSG）均购于美国Sigma公司，D－MEM培养基、牛血清蛋白（BSA）、RIPA缓冲液均购于美国Thermo公司，胎牛血清（PBS）购于美国Invitrogen公司，抗α－平滑肌肌动蛋白（α－actin）单克隆抗体购于美国DakoCytomation公司，Dharma FECT2 siRNA转染试剂盒、SERCA2 siRNAs及错义序列siRNA均购于美国Dharmacon公司，RNeasy mini试剂盒购于德国Qiagen公司，GoScriptTM逆转录系统购于美国Promega公司，SYBR®Premix Ex TaqTM购于日本TaKaRa公司，PVDF膜及核蛋白提取试剂盒购于美国Millpore公司，Fura PE－3/AM购于美国Santa cruz公司，ECL试剂盒购于英国Amersham公司，大鼠重组IL－17购于美国R＆D公司，IL－8 ELISA试剂盒购于比利时Biosource SA公司，单抗 SERCA2（ab137020）及单抗 GAPDH（ab181603）购于英国 Abcam公司，单抗IP3R1（NBP1－95155）购于美国Novus公司，BCA蛋白定量试剂盒及HRP－偶联二抗购于上海碧云天生物科技有限公司，单抗IκBα（9242）、单抗 NF－κB p65（4764）及单抗 β－actin（4970）均购于美国Cell Signaling Technology公司，SERCA2、三磷酸肌醇受体（IP3R1）、IL－8和 β－actin引物自行设计后由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型构建及处理 按照随机数字表法将30只大鼠分成哮喘1组、哮喘2组和正常组，每组10只。哮喘模型制作参照文献[6] 略作调整，哮喘1组和哮喘2组：第1天和第8天将1ml含1mg OVA和100mg氢氧化铝混合液进行腹腔注射致敏，在第17～21天分别用1%和2%OVA盐水经空气压缩雾化器每日雾化吸入30min。正常组：用生理盐水进行相同的处理。所有大鼠在第23天处死。

1.2.2 原代大鼠ASMCs分离和培养 取出气管组织放入预冷无菌磷酸缓冲液PBS中，去除内外膜及软骨，剩余平滑肌组织置入37℃含2mg/ml BSA、2mg/mlⅠ型胶原酶和20U/mlⅣ型弹力蛋白酶的缓冲液中消化1h。将得到的细胞混悬液离心，去除碎片，并在含L－谷氨酰胺（2mM）、青霉素（100U/ml）、链霉素（100μg/ml）、两性霉素 B（1.25μg/ml）和 10%FBS的 D－MEM 培养基中再混悬，置于37℃、5%CO2孵箱培养。本实验所用的原代细胞经抗α－actin染色鉴定显示＞95%。

1.2.4 qRT－PCR测定mRNA表达 利用RNeasy迷你试剂盒从约1×106个细胞裂解液中提取总RNA，采用GoScriptTM逆转录系统获得cDNA，然后根据SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明进行PCR定量检测，使用引物序列如下：SERCA2，上游：5′－CCC TGT ACA GTT TGC TTA－3′，下游：5′－GCT GTG AGG AAC TGA ACC－3′；IP3R1，上游：5′－AGC CAT GTT AGA GGC TCA CAC GTT－3′，下游：5′－CCT GGG AGA TGA CAC TGA CTG GT－3′；IL－8，上游：5′－GAG CAA CCC ATA CCC ATC GA－3′，下游：5′－TGG TCC CAC CAT ATC TTC TTA ATC T－3′；β－actin，上游：5′－TGG CCT CAC TGT CCA CCT TCC A－3′，下游：5′－CGC AGC TCA GTA ACA GTC CGC C-3′。β-actin作为内参，反应条件：95℃预变性15min，94℃变性 15s，56℃退火 20s，72℃延伸 20s，共 45个循环。反应系统按照厂商建议构建，利用2-ΔΔCt法计算相对基因表达量。每组实验重复3次。

1.2.5 Western blotting测定蛋白含量 将细胞裂解于含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液，再利用核蛋白提取试剂盒收集总蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒对获得的总蛋白浓度检测后进行电泳并将其转至PVDF膜上，用含5%脱脂乳Tris缓冲液进行封闭1h，分别加入兔抗 SERCA2、IP3R1、IκBα、NF-κB p65、β-actin（浓度 1∶1 000）或 GAPDH（浓度 1∶10 000），4℃过夜，再加入 HRP-偶联二抗（浓度 1∶3 000），室温孵育 1h，利用ECL试剂盒显现印记，蛋白带光密度由Image J软件进行定量。

1.2.6 Fura PE-3/AM测定[Ca2+] i 用1μM BK刺激ASMCs诱导SR钙释放，参照文献[8] ，将盖玻片上的ASMCs（约1×103/片）在加有0.5μM钙离子荧光指示剂Fura PE-3/AM的Hepes缓冲生理盐水中避光室温孵育90min，置于倒置显微镜下选好测定的细胞，以510nm为发射波长，以340 nm和380 nm为激发波长进行测定，负载Fura PE-3/AM细胞的荧光比值（R340/380）用于表示[Ca2+] i。

1.2.7 ELISA法测定IL-8水平 从正常或哮喘大鼠分离得到的ASMCs，经SERCA2 siRNA或错义序列siRNA转染，通过Western blotting确定SERCA2是否被下调后，置于含或不含10μM PDTC、含或不含0.1ng/ml重组大鼠IL-17的37℃、5%CO2孵箱培养[9]，24h后收集上清液，利用ELISA试剂盒检测IL-8水平。

1.3 统计学处理 采用GraphPad统计软件，计量资料以表示，组间两两比较采用Student’st检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组SERCA2和IP3R1表达的比较 见表1。

表1 各组SERCA2和IP3R1表达的比较

由表1可见，与正常组相比，哮喘组SERCA2 mRNA及蛋白表达均减少（P＜0.05或0.01），哮喘2组减少则更显著（均P＜0.01），而哮喘组IP3R1 mRNA及蛋白的表达与正常组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 各组[Ca2+] i的比较 见图1。

20世纪80年代，全球化进程进一步加快，世界各国间的交流日益频繁，许多翻译学者逐渐摆脱翻译研究的局限性，开始对翻译进行多角度宏观研究，大大拓展了翻译研究的内涵和外延意义。操控理论便是在此背景下形成和发展起来的。

图1 各组[Ca2+] i的比较（a：经BK诱导后的钙瞬变峰值水平；b：钙峰恢复至基线所需时间；与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

由图1可见，与正常组比较，哮喘组对BK诱导的钙瞬变峰值下降（P＜0.05或0.01）；哮喘2组需要更长时间重新摄取钙使[Ca2+] i恢复至基线水平（P＜0.01）。

2.3 各组IL-8 mRNA表达和分泌的比较 见表2。

由表2可见，哮喘组IL-8 mRNA基础值和经IL-17刺激后的诱导值均较正常组增加（P＜0.05或0.01），IL-8的分泌显著增加（均P＜0.01）。

表2 各组IL-8 mRNA表达和分泌的比较

2.4 经siRNA转染后各组IL-8 mRNA表达和分泌的比较 见图2、表3。

图2 明确基因下调组中SERCA2基因被下调（与阴性对照组及正常对照组比较，**P＜0.01）

表3 经siRNA转染后各组IL-8 mRNA表达和分泌的比较

由图2、表3可见，在明确SERCA2基因被下调后，无论有无IL-17刺激，基因下调组IL-8 mRNA表达和分泌均显著增加（均P＜0.01），而与哮喘对照组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.5 各组NF-κB的活化及改变 见图3。

由图3可见，哮喘组IκBα磷酸化和NF-κB p65核转位较正常组均增加（P＜0.05或0.01），基因下调组和TSG抑制组的NF-κB p65核转位亦增加（P＜0.05或0.01）。

2.6 经PDTC处理后各组IL-8 mRNA表达和分泌的比较 见表4。

由表4可见，基因下调组、哮喘对照组和正常对照组在IL-17刺激下，经PDTC处理后，IL-8 mRNA表达和分泌均减少（P＜0.05或0.01）。

图3 各组NF-κB的活化及改变（a：各组NF-κB的活化，包括IκBα磷酸化和NF-κB p65核转位；b：基因下调组和TSG抑制组NF-κB p65核转位的改变；与正常组及阴性对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 讨论

ASMCs的生物活性是通过[Ca2+] i变化来完成的[10]。[Ca2+] i升高导致细胞膜Ca2+通道和钠/钙交换（NCX）的活化，促进钙内流，进而引发IP3R或兰尼受体（RyR）介导的SR进一步释放储存钙，细胞内钙信号的终止主要通过NCX和细胞膜Ca2+-ATP酶（PMCA）使细胞外钙浓度下降，以及SERCA快速摄取钙至SR储存使[Ca2+] i恢复正常来调控[11]。Mahn等[8]研究发现，哮喘患者ASMCs的SERCA2表达减少，经BK诱导后的[Ca2+] i峰值较正常人减弱，并且在恢复基线水平能力被延迟了大约50%，由于内钙稳态恢复能力下降引起的[Ca2+] i持续增高，导致细胞增殖和分泌功能增强，而通过siRNA技术下调正常人群来源的ASMCs中SERCA2基因表达，可呈现类似哮喘ASMCs的扩展、增殖和eotaxin-1释放增强，因而认为在哮喘患者ASMCs中SERCA2表达缺陷可导致细胞高分泌和高增殖表型，ASMCs钙调控异常可能在气道重塑中有重要作用。本实验发现，哮喘组SERCA2的转录和翻译均减少，且与病情严重程度相关。基于IP3R为SR上的一种钙释放通道，正常组和哮喘组IP3R1的表达并无差异，提示哮喘大鼠SERCA2的异常改变并不是因为在总SR数量上的减少[8]。另外，哮喘组对BK诱导的钙瞬变峰值下降，钙峰恢复至基线水平所需的时间亦更长，提示哮喘大鼠ASMCs中SR的钙储存及再摄取功能受损，SERCA2在哮喘大鼠ASMCs钙稳态失衡中发挥着重要的作用。

表4 经PDTC处理后各组IL-8 mRNA表达和分泌的比较

哮喘的发生、发展由庞大的细胞因子群参与，其中IL-8是目前已知活性最强的中性粒细胞趋化因子。Hosoki等[12]在对BALF中48种细胞因子的分析中发现，中性粒细胞和IL-8是唯一能区分控制性哮喘和未控制性哮喘的炎性成分。IL-8可能通过特定的CXC受体激活ASMCs引起其收缩和迁移，导致气道过度狭窄和重塑[13]。本实验发现，哮喘组IL-8的基础值及经IL-17刺激后的诱导值均较正常组增加，而基因下调组IL-8的mRNA表达和分泌亦显著增加，类似哮喘组中IL-8的变化，因此认为哮喘大鼠ASMCs中SERCA2表达的减少可导致IL-8分泌亢进。

细胞内Ca2+作为重要的第二信使具有一种特殊的运动形式，即钙振荡，是Ca2+在细胞膜两侧和细胞器膜两侧的运转共同形成的[14]。吸入β受体激动剂即是通过降低ASMCs钙振荡波幅来缓解平滑肌的痉挛[15]。既往研究表明细胞内钙调节与NF-κB活化和炎症信号反应有关[16]。NF-κB作为一种核转录因子，广泛参与免疫应答及炎症反应，致敏原、臭氧、病毒感染等哮喘诱发因素均可刺激NF-κB活化，且糖皮质激素作为哮喘主要控制药物则是NF-κB活化的有效阻滞剂[17]。哮喘患者气道中NF-κB活化明显高于正常，在抑制细胞的NF-κB活化后，气道炎症明显减轻，相关炎性因子表达亦下调[18]。镍离子作为一种广谱Ca2+通道阻滞剂可减少Ca2+内流，能消除人ASMCs中CD-40诱导的NF-κB活化[19]。本实验发现，哮喘组NF-κB活化较正常组增加，正常ASMCs经SERCA2基因下调或者利用TSG抑制SERCA2功能后均可促进NF-κB活化，提示ASMCs中SERCA2表达或功能不足时可影响NF-κB的活化。在应用NF-κB活化的特异性抑制剂PDTC后[20]，无论SERCA2表达或功能是否受损，IL-17刺激诱导后IL-8 mRNA表达和分泌均减少，因此推测在哮喘大鼠ASMCs中因SERCA2表达的减少导致了钙振荡的改变，使NF-κB活化增强，经IL-17介导使得IL-8的产生增加。综上所述，哮喘大鼠ASMCs中SERCA2的不足，可导致钙稳态的改变，可能通过增强的NF-κB活性介导IL-8分泌亢进，进而加重哮喘气道炎症及重塑，SERCA2也许可能作为一个哮喘防治的新靶点。