超高效液相色谱法测定原料乳中的水杨酸

邵瑞婷,丁学妍,张丽华,姜 洁

(北京市食品安全监控和风险评估中心，北京 100041)

水杨酸(Salicylic acid)又称2-羟基苯甲酸，为白色针状结晶或单斜棱晶，有辛辣味，微溶于水，溶于丙酮、松节油、乙醇、乙醚、苯和氯仿，具有防腐、消炎作用[1-2]，存在于自然界的柳树皮、白珠树叶、甜桦树中，是一种天然的“消炎药”.水杨酸主要作为医药工业的原料使用，也经常作为防腐剂被用于化妆品中，此外还被用于染料、橡胶、香精配制等.正是由于水杨酸具有防腐杀菌作用，被一些不法商贩利用[3]，他们为了延长原料乳的保存期限，在原料乳中加入水杨酸钠，这样的原料会影响最终的产品质量，对人体产生危害[4-7].

目前，包括我国和欧盟在内的多个国家，对于水杨酸在食品中的使用都有限制规定[8-9].我国将其列为“允许使用的食品用合成香料”[9]，但未标明其可作为防腐剂在食品中使用.此外，即使作为香料，也明确标注出不得在巴氏杀菌乳、杀菌乳、发酵乳等以原料乳生产的产品中添加.国内外对于水杨酸的检测方法，主要集中在化妆品[10-12]、医药[13-15]及植物生长调节剂[16-23]方面，而对于原料乳中的水杨酸检测，没有明确的有针对性的定量检测方法[24-26].本方法具有操作简单、重现性好、灵敏度高、杂质干扰小等特点，可以用于原料乳中水杨酸的检测.

1 试验部分

1.1 仪器

Agilent 1260超高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；超声波萃取仪(北京五洲东方)；多管涡旋振荡器(北京华威中仪)；冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司).

1.2 试剂与标准品

乙腈(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；甲醇(色谱纯，美国Thermo Fisher公司)；磷酸(优级纯，默克，质量分数85%)；氨水(优级纯，国药，质量分数25.0%～28.0%).原料乳样品：采集于北京市大型乳企生产用原料乳.

水杨酸标准品购自中国食品药品检定研究院.

精确称取水杨酸标准品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的标准储备溶液，避光、-18 ℃下保存.

用70%乙腈水(体积分数)逐级稀释混合标准溶液，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的标准溶液系列.

磷酸溶液：称取11.5 g磷酸，精确至0.01 g，加入950 mL水，用氨水调节pH至2.5，加入水至1 000 mL.

流动相A液(磷酸水)：量取磷酸溶液200.0 mL，并用水稀释至1 000 mL[8].

流动相B液(磷酸甲醇)：量取磷酸溶液250.0 mL，并用甲醇稀释至1 000 mL[8].

1.3 样品前处理

称取2 g混匀试样(精确到0.01 g)置于10 mL刻度离心管中，加入80%乙腈水(体积分数)溶液至5 mL刻度线，涡旋30 s，超声提取25 min，以10 000 r/min在0 ℃下离心5 min，吸取上层提取液1 mL，过0.22 μm微孔滤膜，供检测.

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×100 mm,3.5 μm)；柱温 25 ℃；二极管阵列检测器(DAD)300 nm；进样体积 10 μL；流速 0.8 mL/min；流动相：A为磷酸水、B为磷酸甲醇，梯度洗脱程序：0～3 min，A由80%线性降到10%;3～8 min，A相保持100%;8～8.1 min，A由10%线性升到80%;8.1～10 min，A相保持80%.

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂选择

分别用甲醇、乙腈、丙酮、氯仿4种有机溶剂对原料乳样品进行提取条件试验(原料乳中水杨酸添加量为5 mg/kg)，结果如图1所示.试验结果表明：乙腈作为提取溶剂，蛋白沉淀效果最佳，其回收率为93%～105%；丙酮及氯仿虽有一定的提取效果，但回收率较低，均不足40%；甲醇作为提取试剂，蛋白沉淀效果不佳，个别出现乳化现象，无法达到良好提取兼净化效果.故选择乙腈作为提取试剂.

图1 不同溶剂提取原料乳中水杨酸的回收率(n =6)Fig.1 Recoveries of salicylic acid in raw milk by different extration solvent (n =6)

对于不同浓度的乙腈作为提取试剂对提取效率的影响也做了相应的研究.选取乙腈质量分数(乙腈∶水，V∶V)分别为10%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的提取试剂，样品中添加水杨酸的质量分数为5 mg/kg,进行测试，结果表明乙腈的质量分数大于60%时，提取效率无明显差异.由于原料乳中本身含有一定量的水分，为保证提取效率，本着节约原则，最终选择质量分数为80%的乙腈(乙腈∶水，V∶V)作为提取试剂.

2.2 样品净化方法的选择

原料乳中含有大量的蛋白质和脂肪，净化的主要目的就是除去脂肪和沉淀蛋白.由于乙腈具备良好的沉淀蛋白的效果，对目标物进行提取的同时，可将原料乳中的蛋白质较为充分的沉淀.冷冻、高速离心又能有效的避免脂肪的干扰，故为降低检测成本，节约检测时间，没有再额外引入其余净化环节.

2.3 提取时间的选择

试验比较了超声提取时间对原料乳中水杨酸提取效率的影响.样品中添加水杨酸的质量分数为5 mg/kg，测试结果如图2所示.由图2可见，随超声时间的增长，目标物的提取效率显著提高，在25 min后达到动态平衡，故最终选择超声提取时间为25 min.

2.4 检出限、定量限与线性范围

分别配制质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的水杨酸标准溶液，自动进样10 μL，进行UPLC分析.将标准系列工作溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积.以标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中水杨酸的质量浓度.方法检出限以加标样品检测色谱峰信噪比S/N≥3确定，方法定量限以加标样品检测色谱峰信噪比S/N≥10确定，具体结果如表1所列.由表1可见，水杨酸在0.5～20.0 μg/mL的线性范围内线性关系良好，线性系数R2大于0.995，能满足定量分析的要求.方法对于水杨酸的检出限均为0.5 mg/kg，定量限均为1.25 mg/kg.

图2 水杨酸不同超声提取时间的提取效率Fig.2 Extraction efficiencies of salicylic acid with different ultrasonic extraction times

表1 水杨酸的线性范围、回归方程及线性相关系数Table 1 Linear ranges,linear equations and correlation coefficients of salicylic acid

2.5 样品的加标回收率

分别在2.00 g原料乳样品中加入含有水杨酸的标准溶液，添加质量分数为1.25、2.5、25 mg/kg.使用优化好的方法进行提取净化，每个添加水平分别测定6份样品，得到水杨酸的回收率和相对标准偏差,结果如表2所列.

表2 水杨酸在不同加标水平下的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs of salicylic acid spiked in three levels(n=6)

由表2可见，回收率范围为88.0%～118.9%，相对标准偏差均小于10%.结果表明，水杨酸在不同的添加水平均得到了满意的回收率和较好的方法重复性.

3 结论

建立了原料乳中水杨酸的超高效液相色谱检测方法.通过乙腈提取，可实现对原料乳样品中水杨酸的检测，具有较高的回收率.该方法灵敏度高、重现性好，已在日常风险监测试验中得到良好的应用.检测160余个采集于北京市及其周边大型乳品企业的原料乳样品，未检测出阳性样本.由于我国的原料乳有很多零散养殖户参与供应，其安全性依然是监管的难点和重点.水杨酸等防腐剂的添加作为重要的风险隐患，一直被监控部门关注.因此，将快速灵敏的原料乳中水杨酸的检测方法应用于日常监管，具有必要性.