甘蓝型紫叶油菜叶色及遗传分析

张宏,李刚，赵福永 (长江大学生命科学学院,湖北 荆州 434025)

我国是世界油菜(BrassicanapusL.)生产大国，其种植面积及总产量均占全球的30%左右[1]。当前，我国农村发展方向从增产增收逐渐转向为生态农业。生态农业不仅可以满足食用需求，而且可以作为特色旅游产业为农村发展打开新天地[2]，因此彩色油菜的选育具有重大的旅游与经济价值。以甘蓝型绿叶油菜与野生芥菜型紫叶油菜为亲本，杂交得到F1代杂种后，经多代自交，紫叶性状已稳定遗传。本研究对选育的甘蓝型紫叶油菜品种进行紫叶叶色性状的遗传分析，对叶片中紫色分布情况进行观察，测定其色素含量，并对花青素的稳定性进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

a、c、e:“中双11号”；b、d、f:自交系紫叶品种图1 “中双11号”与自交系紫叶油菜植株及叶片

以甘蓝型绿叶油菜“湘油15号”为母本，以野生芥菜型紫叶油菜为父本，在作物试验田杂交得到F1代种子[3]，F1代自交生成F2代植株。再经多代自交后，获得稳定紫色叶色性状的甘蓝型油菜品种(图1)。对照绿叶品种“中双11号”(ZS11)为套袋自交留种。

1.2 紫色叶色性状的遗传规律分析

采用亲本自交、杂交，F2代植株自交和回交，观测子代植株苗期叶色性状，得出紫色叶色与绿色叶色性状分离比，并利用统计学方法χ2测验[4]进行适合性检验。

1.2.1 亲本自交、杂交，初步预测紫叶与绿叶性状显隐性

2016年10月，在作物试验田，播种纯合甘蓝型绿叶油菜“湘油15号”(母本)与纯合野生芥菜型紫叶油菜(父本)，于花期选取健康植株做自、杂交(正交与反交)试验得到F1代种子。F1代植株自交收获F2代种子，并统计种子数量。

试验地设计小区为4m2,共20个小区,各试验小区有相同的水、肥、气、热条件。随机选取2块小区各播种100株母本、父本自交F2代种子，行、株距为17cm，随机选取8块小区各播种100株正交F2代种子，随机选取10块小区各播种100株反交F2代种子。于苗期观测叶色分离比，并用χ2测验进行适合性检验。

1.2.2 F2代植株回交，观测BC1代植株性状确认遗传特征

2017年10月，在作物试验田播种纯合甘蓝型绿叶油菜“湘油15号”(母本)、纯合野生芥菜型紫叶油菜(父本)、F1代杂合种子，于花期选取健康植株回交。收获种子，并统计种子数量。

试验地设计小区为4m2,共8个小区，各试验小区有相同的水、肥、气、热条件。随机选取5块小区各播种100株F1代杂合子与母本(纯合“湘油15号”绿叶油菜)回交获得的子代BC1a种子，随机选取3块小区各播种100株F1代杂合子与父本(纯合野生芥菜型紫叶油菜)回交获得的子代BC1b种子，行、株距均为17cm。于苗期观测叶色分离比，用χ2测验进行适合性检验。

1.3 甘蓝型紫叶油菜叶片的解剖学特征观察

2017年1月6日，取甘蓝型紫叶油菜、“中双11号”绿叶油菜健康叶片，用样品袋存放于冰盒中运至显微室。制作徒手切片,在UM158A光学显微镜(上海光学仪器厂)下观察、拍照。

1.4 甘蓝型紫叶油菜叶片各色素含量测定

2016年12月27日，选取健康甘蓝型紫叶油菜10株，分别取其第10片真叶；选取1株健康“中双11号”绿叶油菜，取第10片真叶。用样品袋编号存放于冰盒中。

1.4.1 蓝型紫叶油菜叶片花青素的提取及含量测定

参考Li等[5]的叶片花青素提取方法，本研究采用95%乙醇∶1.5mol/L盐酸=85∶15(V∶V)配制花青素提取液。在预冷的洁净研钵中，用液氮研磨样品。各取0.4g研磨物置于相应编号的10mL离心管中,再分别加入4mL花青素提取液，于4℃、黑暗条件下150r/min轻摇18h。将混合溶液在4℃、5000r/min条件下离心10min。取上清液至洁净新管，置冰上保存，用UV-2600型紫外分光光度计(日本岛津)测定波长530nm的光密度D530nm,并按以下公式计算花青素含量：

Cant=D530nm·V·N/(98.2·M)

式中：Cant为花青素含量，mg/g;V为提取物体积，mL；N为稀释倍数；98.2为提取溶液的摩尔吸收值;M为叶片质量，g。

1.4.2 甘蓝型紫叶油菜叶片叶绿素、类胡萝卜素的提取及含量测定

参考唐延林等[6]的叶片叶绿素、类胡萝卜素提取方法，本研究用丙酮∶无水乙醇∶蒸馏水=4.5∶4.5∶1(V∶V∶V)配比配制提取液。在预冷的洁净研钵中，用液氮研磨样品。各取0.2g研磨物置于相应编号的洁净的300mL锥形瓶中,再分别加入100mL提取液，于25℃、黑暗条件下150r/min轻摇至研磨物变为无色。将混合溶液在25℃、5000r/min条件下离心10min。取上清液至洁净新管，置冰上保存，用UV-2600型紫外分光光度计(日本岛津)分别测波长为663nm(叶绿素a吸收峰)、645nm(叶绿素b吸收峰)、440nm的光密度值。按文献[6]的方法计算叶绿素与类胡萝卜素含量。

1.5 甘蓝型紫叶油菜花青素在不同温度和酸碱性条件下的稳定性测定

1.5.1 磷酸缓冲液(pH=7)的配制

称取13.61g的固体KH2PO4，用蒸馏水溶解，定容至100mL得甲液；称取22.82g的固体K2HPO4·3H2O，用蒸馏水溶解，定容至100mL得乙液；量取3.85mL甲液与6.15mL乙液混合，用蒸馏水定容至100mL。

1.5.2 不同pH的花青素液制备

将提取到的花青素混合后，取混合液15mL，稀释10倍，每30mL分装至5个洁净试管中，再分别加入10mL磷酸缓冲液，以NaOH溶液(1.5mol/L)、HCl溶液(1.5mol/L)用FE20-FiveEasyTMpH计(上海怡临仪器)分别调节pH至1、3、5、7、9。经改变pH的混合液，采用磷酸缓冲液定容至50mL，每8mL分装至6个洁净具塞试管中。

1.5.3 不同pH和温度下花青素的稳定性测定

将上述6份5种不同pH的花青素液分别在4℃冷藏、25℃常温、45℃水浴、65℃水浴、85℃水浴、100℃沸水浴条件下处理20min。用数码相机(Canon PowerShot G7)于自然光条件下拍照。用UV-2600型紫外分光光度计(日本岛津)测波长530nm的光密度D530nm，并计算各自花青素含量[6]。

2 结果与分析

2.1 甘蓝型紫叶油菜紫色叶色性状的遗传规律

试验结果(表1)表明，纯合甘蓝型绿叶油菜“湘油15号”自交F2代植株全为绿叶，纯合野生芥菜型紫叶油菜自交F2代植株全为紫叶，不发生性状分离。正交、 反交F1代植株全表现为紫色叶色性状，F2代发生性状分离，紫叶∶绿叶≈3∶1。正反交出现同样的性状分离比，说明该叶色性状为细胞核遗传[7]。根据F2代性状分离比得出结论：叶色紫色性状对绿色性状为显性，且受1对等位基因控制[8]。

表1 紫叶芥与绿叶甘及其杂交F1、F2及BC1群体叶色统计

将F1代植株与纯合母本(甘蓝型绿叶油菜“湘油15号”)回交检测，后代植株发生性状分离，紫叶∶绿叶≈1∶1。将F1代植株与纯合父本(野生芥菜型紫叶油菜)回交检测，后代全表现为紫色叶色。回交检测结果符合上述结论。

2.2 甘蓝型紫叶油菜叶片的解剖学特征

取甘蓝型紫叶油菜、“中双11号”绿叶油菜健康叶片，制作徒手切片，在显微镜下以100倍、400倍放大倍数观察切片，观察结果(图2、3)显示紫叶叶片紫色分布在上表皮细胞及临近的栅栏组织中。

图2 甘蓝型紫叶油菜叶片纵剖面显微图(左：100× 右：400×)

图3 “中双11号”绿叶油菜叶片纵剖面显微图(左：100×；右：400×)

2.3 甘蓝型紫叶油菜叶片各色素含量测定

取10株甘蓝型紫叶油菜与“中双11号”绿叶油菜第10片真叶，提取花青素、叶绿素、类胡萝卜素，并测定其含量。从图4可以看出，甘蓝型紫叶油菜叶片花青素含量远远高于“中双11号”绿叶油菜；甘蓝型紫叶油菜叶片叶绿素含量普遍低于“中双11号”绿叶油菜；类胡萝卜素含量两者之间没有明显区别。

注:Z1～Z10为紫叶油菜叶片；ZS11为“中双11号”绿叶油菜叶片图4 甘蓝型紫叶油菜与“中双11号”绿叶油菜叶片的色素含量

2.4 甘蓝型紫叶油菜花青素在不同温度、酸碱性条件下的稳定性

图5 甘蓝型紫叶油菜花青素在不同温度和酸碱性条件下的颜色

温度和pH是影响花青素颜色和稳定性的2个最主要的因素。在可见光谱内，花青素溶液的最大吸收峰在 530nm 处，而当pH由1逐渐升到9时，其最大吸收峰会产生红移现象，溶液红色变浅而蓝色或绿色会加深。对不同pH和温度处理后的花青素溶液检测发现，当pH≤3时，花青素溶液的颜色仍表现为深红色或红色；当5≤pH≤7时，花青素溶液颜色逐渐透明；当pH≥9时，花青素溶液随着温度的升高由蓝绿(4℃)逐渐变为浅黄(100℃)。测定各自的光密度，计算花青素含量。将温度、pH和对应的花青素含量导入MATLAB R2017a 软件，利用griddata函数构建三维模型(图6)。由图6可以看到，随温度升高与pH增大，花青素含量逐渐降低，因此低温、酸性条件有助于花青素的保留。

3 结论与讨论

我国油菜种植有着悠久的历史和丰富的经验，把油菜生产融于新农村建设和休闲旅游产业中，是一个崭新的发展方向。种植具有观赏价值的紫叶油菜不仅可满足人们食用需求而且可以创造独特的自然景观，在乡村旅游热的今天能间接增加农民收入。

花青素作为一种天然水溶性色素，安全、无毒，在食品、化妆品行业有着巨大的应用潜力[9，10]。花青素还具有抗氧化活性，在预防神经性、心血管疾病、癌症和糖尿病等难治愈疾病方面有着重要作用[11]。紫叶油菜叶片含有丰富的花青素，为传统上只作为油料作物的油菜提供了新的利用方向。

芥菜型油菜株型松散、枝叶稀疏，抗旱、抗寒，产量不高，主要分布在我国西北和西南的地区；甘蓝型油菜植株高大，枝叶繁茂，耐寒、耐肥、产量更高，适用种植范围更广[12]，选育具有紫叶性状的甘蓝型油菜相比野生芥菜型紫叶油菜有着更大的实用价值。本研究以纯合甘蓝型绿叶油菜“湘油15号”(母本)与纯合野生芥菜型紫叶油菜(父本)杂交，获得了该杂交组合的F1杂交种子，随后进行了连续8年的自交和选择，目前该甘蓝型紫叶油菜紫叶性状表现稳定遗传[3]。

图6 不同温度和酸碱性条件下的花青素含量

观测、统计子代性状分离比例，结合杂合F1代回交验证情况，符合孟德尔遗传定律，叶色紫色性状对绿色为显性，且受1对等位基因控制。显微观察紫色叶片，发现紫色分布于叶片的上表皮及临近的栅栏组织中。提取并测量甘蓝型紫叶油菜与绿叶油菜叶片的花青素、叶绿素、类胡萝卜素，发现紫叶的花青素含量远高于绿叶，叶绿素含量普遍低于绿叶。设置不同梯度的温度与pH处理甘蓝型紫叶油菜的花青素，观测其含量得出结论：低温、酸性环境能提高花青素的稳定性，有利于花青素的保留。对紫色叶色的遗传规律及表型研究，对紫叶油菜品种的选育及进一步研究有着重要意义。