非小细胞肺癌中免疫检查点表达与临床特征及预后的关系分析

黄维，张庆娟，刘柯，徐茜，周美英

宜宾市第一人民医院肿瘤科，四川宜宾644000

肺癌作为临床最常见的恶性肿瘤，近年来发病率及病死率持续上升，均居恶性肿瘤第1位，严重威胁人类的健康和生命[1]。非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是最常见的肺癌类型，约占肺癌的80%以上，大多数患者确诊为NSCLC时已处于晚期，采取化疗、放疗等传统治疗方法效果均不理想[2]。近年来，程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称 PD-1），程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1），B、T淋巴细胞衰减因子（B-and T-lymphocyte attenuator，BTLA）、淋巴细胞活化基因3（lymphocyte activating 3，LAG3）及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）等免疫检查点的研究逐渐成为NSCLC治疗研究的热点[3]。研究证实免疫检查点能够抑制T细胞等的免疫功能，介导肿瘤细胞免疫逃逸[4]，因此，通过免疫检查点阻断剂对其表达进行干涉，成为治疗NSCLC的一种新型、有效的治疗方式。目前临床关于免疫检查点与NSCLC患者临床特征及预后关系的报道较少。基于此，本研究选取了144例NSCLC患者的肿瘤组织标本，探讨其免疫检查点表达情况与临床特征及预后的关系，以期为NSCLC免疫治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年4月至2014年4月于宜宾市第一人民医院接受手术治疗的NSCLC患者的肿瘤组织标本。纳入标准：①符合NSCLC诊断标准并经组织学检查确诊为NSCLC[5]；②患者术前未接受放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他肿瘤；②患者有或疑似有自身免疫性疾病；③患者接受过类固醇治疗。根据纳入、排除标准，共纳入144例NSCLC患者的肿瘤组织标本。144例患者中，男95例，女49例；年龄为37～78岁，平均年龄为（55.35±16.14）岁；TNM分期[6]：Ⅰ期52例，Ⅱ期29例，Ⅲ期63例；吸烟65例，不吸烟79例；病理类型：腺癌86例，鳞癌32例，其他26例；有淋巴结转移69例，无淋巴结转移75例。

1.2 检测方法

选取纳入研究的肿瘤组织标本，采用免疫组织化学法对肿瘤组织的PD-L1、PD-1、BTLA、CTLA-4和LAG3的表达情况进行检测：3µm连续切片，粘贴于载玻片上，滤纸吸干水分，置于60℃烤箱中烘烤2 h后取出，置于二甲苯中脱蜡，每次3 min，连续3次，依次经100%、80%、60%无水乙醇浸泡2 min，自来水洗净。经乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修复液修复后，将切片浸泡在配置好的H2O2溶液中，培养10 min后，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗 3次，每次3 min。PBS清除后，先后向切片上滴加配置好的一抗、二抗，分别培养1 h、10 min、30 min，并用PBS冲洗。清除PBS后，滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂，待切片显色后，用自来水冲洗，置于苏木素溶液中复染30 s后，用自来水冲洗，吹风机吹干，封片。

1.3 观察指标及评价方法

评价肿瘤组织标本中PD-L1、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG3的表达情况。PD-1、PD-L1表达情况判定：阳性细胞比例＜5%为阴性，阳性细胞比例≥5%为阳性。采用免疫组织化学半定量评分系统，得出LAG3的平均值为87分，以此为截点，≤87分为阳性，＞87分为阴性；BTLA的平均值为179分，以此为截点，≤179分为阳性，＞179分为阴性；CTLA-4的平均值为125分，以此为截点，≤125分为阳性，＞125分为阴性。

1.4 随访

随访3年，随访方式为门诊及电话随访。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件分析数据。计数资料以例数和率（%）表示，采用χ2检验；NSCLC患者预后的单因素分析采用χ2检验；将单因素分析后差异有统计学意义的因素引入Cox风险比例模型进行多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床特征NSCLC患者肿瘤组织的免疫检查点阳性表达率比较

144例患者中，有淋巴结转移的患者肿瘤组织的PD-L1的阳性表达率明显高于无淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（χ2=0.619，P=0.006）；不同病理类型患者肿瘤组织中的PD-L1的阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=1.259，P=0.013）；吸烟的患者肿瘤组织中的PD-1阳性表达率高于不吸烟的患者，差异有统计学意义（χ2=2.031，P=0.018）；女性、吸烟、有淋巴结转移的患者肿瘤组织中的BTLA阳性表达率均高于男性、不吸烟、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（χ2=0.896、2.047、1.632，P=0.047、0.034、0.030）；不同TNM分期患者肿瘤组织中的LAG3阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2=0.951，P=0.035）。（表1）

表1 不同临床特征NSCLC患者肿瘤组织的免疫检查点阳性表达情况[ n=144， n（%）]

2.2 NSCLC患者预后的单因素分析

PD-L1、PD-1阴性表达及LAG3阳性表达患者的中位无疾病生存（disease-free survival，DFS）时间分别为23.5、22.0、35.5个月，均长于 PD-L1、PD-1阳性表达及LAG3阴性表达患者的17.0、16.0、14.5个月，差异均有统计学意义（χ2=6.856、4.611、4.169，P＜0.05）；PD-L1阴性表达及BTLA、LAG3阳性表达患者的3年DFS率分别为38.5%、35.0%、48.5%，均高于PD-L1阳性表达及BTLA、LAG3阴性表达患者的23.2%、27.1%、19.1%，差异均有统计学意义（χ2=5.387、5.359、3.117，P＜0.05）；BTLA、CTLA-4阳性表达与阴性表达患者的中位DFS时间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；PD-1、CTLA-4阳性表达与阴性表达患者的3年DFS率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2 免疫检查点阳性表达与阴性表达患者的中位DFS时间及DFS率情况

2.3 NSCLC患者预后的多因素分析

采用Cox回归模型进行NSCLC患者预后的多因素分析，结果显示PD-L1、LAG3是NSCLC患者预后的影响因素（P＜0.01）。（表3）

表3 Cox回归模型分析

3 讨论

NSCLC是肺癌的主要类型，传统的治疗方法对该病的治疗效果不甚理想，5年病死率达85%以上[7]。因此，探索新的治疗方法成为NSCLC研究的热点。近年来的研究发现，免疫检查点具有抑制T细胞功能及阻断免疫信号通路的作用，在肿瘤的发生发展过程中起重要的作用[8]。其中，PD-1是主要表达在活化T细胞表面的抑制性受体，PD-L1是PD-1的配体，两者结合，可抑制T细胞的活化，减弱T细胞对肿瘤细胞的抑制，并诱发肿瘤细胞免疫逃逸。BTLA是表达在B、T细胞的抑制性受体，在机体抗肿瘤免疫应答中发挥负性调节作用。LAG3在多种肿瘤微环境中表达，与其配体主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ）结合后，调节T细胞功能，参与肿瘤细胞免疫逃逸[9-10]。研究显示免疫检查点表达与恶性肿瘤患者临床特征及预后相关，但有关免疫检查点表达与NSCLC的临床特征及预后关系的报道较少[11]。因此，本研究对此作进一步研究，试图为NSCLC的细胞免疫治疗提供更多的临床参考依据。

PD-1最早发现于凋亡T细胞杂交瘤中，PD-L1作为其主要配体之一，在机体内起负性调控免疫作用，PD-L1/PD-1信号通路在机体免疫调控中发挥主导作用，利用这一特点，异常刺激PD-L1/PD-1信号通路，可使T细胞活化和增殖受到抑制，诱导T细胞凋亡，实现肿瘤细胞免疫逃逸[12]。研究表明，PD-L1和PD-1在NSCLC肿瘤组织中阳性表达率升高，且PD-L1阳性表达率越高，患者预后越差[13]。本研究显示，PD-L1表达与NSCLC患者预后相关，是患者预后不良的影响因素，与以上研究结果一致。研究显示，BTLA、CTLA-4高表达与胃癌患者预后不良紧密相关[14]。BTLA是一种新被发现的抑制性受体，通过与疱疹病毒侵入介质相结合，起到调节T细胞活化、增殖和凋亡的作用，从而发挥其负性调节作用。CTLA-4主要表达在CD4+T细胞表面，表达在抗原呈递细胞的CD80/CD86是其配体，T细胞激活后，两者结合可抑制T细胞活化和增殖。本研究显示，BTLA表达与患者的性别、是否吸烟及有无淋巴结转移有关，而CTLA-4与NSCLC患者的性别、年龄、是否吸烟、TNM分期、有无淋巴结转移、病理类型均无关，与以上研究结果不同，可能是肿瘤类型不同，或者是本研究样本量较少，导致结果存在差异。研究显示，在结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中发现LAG3阳性表达率升高，且其表达与肿瘤的发生发展存在一定的关联[15]。本研究显示，不同TNM分期患者肿瘤组织中的LAG3阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；Cox回归模型分析显示LAG3是NSCLC患者预后的影响因素。LAG3是一种负性免疫刺激因子，在多种肿瘤微环境中异常表达，和MHC-Ⅱ结合后能够起到负性调控T细胞的作用，从而导致肿瘤免疫逃逸。综上，PD-1与LAG3在肿瘤组织中存在共表达现象。但也有研究显示，当同时阻断PD-1与LAG3的信号通路时，T细胞能够恢复正常的分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的功能，但只阻断LAG3信号通路时，这一分泌功能则不会恢复，说明肿瘤细胞逃逸机制十分复杂，免疫检查点存在不同的共表达现象，在肿瘤细胞逃逸机制中发挥协同或排斥作用，从而影响肿瘤的发生和发展。

综上所述，NSCLC患者肿瘤组织中免疫检查点PD-1、PD-L1、BTLA、LAG3的表达与患者的临床特征有一定的关系，PD-L1、LAG3是NSCLC患者预后的影响因素，对预测患者预后及指导细胞免疫治疗有重要的意义。