利用多能干细胞评估神经发育毒性的研究进展

王丹丹，裴轶劲

诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是通过诱导成熟的体细胞表达特定基因得到的与胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）类似的细胞类型[1]。iPSCs 和 ESCs 在体外均具有无限增殖和多向分化的能力，两者在药物筛选、细胞治疗等方面都发挥着重要作用，然而 iPSCs 来源广泛，取材方便，其获取可以避免医学伦理问题。传统的发育毒性研究方法不仅需要大量的实验动物，而且实验周期长，操作繁琐，还存在种属差异。1981年，Evans 和 Kaufman[2]首次从小鼠的囊胚内细胞团中获得小鼠 ESCs。1997年，Spielmann 等[3]利用小鼠 ESCs 向三胚层分化的特性建立了体外替代模型“胚胎干细胞试验”，并成为体外发育毒性研究的经典方法。随后，人 ESCs 和人 iPSCs 被人们获取并应用于发育毒性体外替代模型中，这些人类细胞的应用解决了种属差异问题[4-6]。体外发育毒性模型最初是通过多能干细胞向心肌分化来评估化学物质的毒性作用，之后向其他谱系分化的产物也逐渐被应用到该模型中。

神经系统发育过程具有高度的时空性，对毒性物质的敏感性取决于所处的发育阶段，处于敏感阶段时，即使较低的毒性物质暴露水平也会造成不可逆转的脑损伤[7]。这种脑损伤有时并未表现出明显的临床特征，而是神经系统的持续性改变，被称为“无声发育毒性”[8]。除了神经系统本身的脆弱性外，人类所接触的神经发育毒性（developmental neurotoxicity，DNT）物质也逐渐增多。据统计显示，从 2006年到 2013年DNT 物质从 6 种增长至 12 种[9]。因此，DNT 问题越来越引起人们的重视。目前，利用多能干细胞建立体外细胞模型已经成为 DNT 研究的重要途径。由多能干细胞分化的神经谱系细胞类型和 DNT 评估方法则成为该研究的重要环节。本文从多能干细胞向神经谱系的分化、DNT 检测指标与应用、高通量技术应用、前景与挑战等四个方面进行综述。

1 多能干细胞向神经谱系的分化

利用多能干细胞建立 DNT 研究的体外细胞模型，有赖于多能干细胞向神经谱系分化技术的发展。随着干细胞培养技术的发展，多能干细胞向神经谱系分化的细胞类型也越来越多（表1），其分化方法主要有两种：贴壁法和拟胚体（embryoid body，EB）法。贴壁法相对简单，易于操作；EB 法尽管存在操作复杂、EB 大小难以控制、生长因子接触不均衡等问题，但和贴壁法相比更接近自然状态下的胚胎发育过程。

表1 多能干细胞向神经谱系分化的概况

续表1

目前，利用多能干细胞分化产生的神经谱系细胞类型有多巴胺神经元、谷氨酸能神经元、星形胶质细胞、耳蜗螺旋神经节细胞等[10-20]，分化形成的神经谱系细胞类型逐渐增多，空间结构也经历了由二维到三维的转变。例如，Reichman 等[19]诱导人 iPSCs 形成含有超微结构光感受器的类视网膜器官；Pamies 等[21]利用 iPSCs 分化形成类似人脑的三维结构，该结构由分化成熟的神经元和胶质细胞组成，可以模拟神经发育过程中的突触形成、神经元自发放电和髓鞘形成等，其髓鞘化可达 40%。此外，Schwartz 等[22]通过将人 ESCs 分化得到的神经祖细胞接种在人工合成的聚乙二醇水凝胶上进行培养，在其分化过程中再按一定比例添加 ESCs 来源的内皮细胞、间充质干细胞和小胶质/巨噬细胞前体，最终形成一个含有不同类型神经元、胶质细胞群和相互连接血管网的三维神经结构。

总之，利用多能干细胞产生的不同类型的神经细胞是体外 DNT 研究的重要基础，还可以依据不同细胞类型对不同性质的化学物质敏感程度不同，如神经祖细胞对诱导凋亡的化学物质较为敏感[23]，建立专一性的细胞替代模型。除此之外，由多能干细胞分化产生的三维神经结构可模拟细胞间的相互作用，在结构和功能上更接近体内神经组织，应用于 DNT 研究可缩小细胞水平与体内水平的差异，进一步提高 DNT 评估的准确性。

2 DNT 检测指标与应用

神经发育过程包括细胞增殖、凋亡、分化、迁移、突触形成、突起和网络形成、胶质生成和髓鞘化等。利用多能干细胞模拟神经发育过程进而评估化学物质的 DNT，可以弥补传统实验的不足，但根据细胞模型如何全面准确地评估化学物质的 DNT 则是人们研究的难点。目前，体外评估 DNT 的检测指标大致分为三类：神经细胞生物学行为、神经元功能及其他指标。

2.1 神经细胞生物学行为

⑴增殖和凋亡：增殖和凋亡贯穿整个神经发育过程，可依据细胞模型的增殖和凋亡水平初步评估化学物质的 DNT，常用的相关检测方法包括细胞计数、BrdU 染色法、CCK8、caspase3/7 活性等[23-30]。

⑵分化：多能干细胞分化形成形态、结构和功能不同的神经元，其本质是基因的选择性表达。通常采用实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、免疫染色等方法检测特异性标记物如神经胶质酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白的表达水平，进而评估毒性物质对神经分化过程的影响[31-32]。

⑶细胞迁移：神经嵴细胞迁移是人类胎儿发育的关键过程之一，倘若该过程受到外部环境或毒性物质的干扰，胎儿会出现畸形发育。体外主要采用细胞划痕实验来评估毒性物质对细胞迁移过程的影响[33-34]。

⑷突起生长：神经元之间通过神经突起相互连接进行信息的传递。Ryan 等[35]利用人 iPSCs 来源的神经元研究发现，一些化学物质并未引起细胞毒性，仅选择性地抑制神经元突起生长。可见，突起生长可作为评估 DNT 的重要指标。

⑸髓鞘化：髓鞘的主要功能是提供轴突的电绝缘和加速电信号的传递，少突胶质细胞是髓鞘的重要细胞来源，可通过检测其前体细胞分化、迁移等过程间接评估化学物质对髓鞘形成影响[24,36-37]。

2.2 神经元功能

现有的研究显示，采取常规的检测手段不一定能够发现化学物质的毒性作用。而电生理特性作为神经元基本的功能特性，可作为评估 DNT 敏感的功能终端。例如，Ylä-Outinen 等[38]将人 ESCs 分化的神经元在 500 nmol/L 氯化甲基汞环境中暴露 72 h 后，神经元网络的电生理信号会显著减少，但细胞增殖、qPCR、免疫染色等检测结果并未发生改变。

2.3 其他指标

除了以上两类检测指标外，还可通过其他指标来评估 DNT。

⑴活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和氧化应激：氧化应激是化学物质引起 DNT 的重要机制[39-40]。例如，砷、汞等会引起神经细胞产生过多 ROS，导致细胞内的氧化-抗氧化系统失衡即氧化应激水平升高，进而引起线粒体功能失调和细胞凋亡[41-42]。因此，可依据多能干细胞向神经分化过程中细胞内 ROS 水平、超氧化物歧化酶等指标来评估化学物质的 DNT[43]。

⑵代谢产物：Pamies 等[43]利用非靶向性代谢组学分析发现，由人 iPSCs 分化形成的三维神经结构在不同的分化阶段其代谢产物存在差异，同时，用鱼藤酮处理 48 h 后细胞代谢产物亦发生明显改变。因此，研究细胞的代谢产物可以帮助人们从代谢角度发现微小差异，并进一步识别化学物质的毒性作用。

⑶microRNA（miRNA）：miRNA 是一种小的内源性非编码 RNA 分子，通过靶向结合 mRNA 来调节基因的表达。目前，已经明确的 miRNA 中超过 50% 在脑中表达，参与调控脑的发育过程[44]。已有研究表明，毒性物质会引 起一些 miRNA 的异常表达，而这些 miRNA 与神经细胞的增殖、迁移、髓鞘化等密切相关[45]。

总之，神经发育过程极其复杂，利用多能干细胞建立体外细胞模型评估 DNT 时，需要综合不同的检测指标才能对化学物质的 DNT 做出正确的评估，相信随着科技的发展，更多敏感指标会被发现并应用于 DNT 研究中。

3 DNT 高通量技术应用

尽管利用多能干细胞建立体外替代模型评估化学物质 DNT 和传统方法相比具有较多优点，但对大量的细胞样本进行不同的处理和检测同样具有挑战性。基于体外模型能高效准确地预测出体内结果是 DNT 研究的关键，因此，高通量技术对于体外 DNT 研究十分必要。目前，利用多能干细胞研究 DNT 方法中也出现一些高通量技术应用。

⑴高含量成像分析（high content imaging analysis，HCA）技术：HCA 是一种能够高通量成像并可对图像信息进行多种模型量化分析的重要工具，可用于大量化学物质的毒性检测[46]。例如，有研究报道将 80 种化学物质分别作用 iPSCs 来源的神经元 72 h 后，应用 HCA 技术对其进行拍照，并从神经元的细胞活性、突起长度、突起数目、分支数等 4 个参数分析图像信息，极大提高了图像信息的处理能力[35]。

⑵微流控芯片：微流控芯片是一个集细胞培养、分化、处理和检测分析于一体的微型平台，可进行二维和三维两种干细胞培养方式，和不同的检测系统结合可对细胞样本进行不同指标的分析[47]。该平台应用于 DNT 研究中，不仅可以实现对大量化学物质的自动处理，还可以从不同的指标分析化学物质的 DNT，提高 DNT 的研究效率和评估准确性。

⑶微电极阵列（microelectrode array，MEA）：MEA 是一种无创性的微电极细胞外电信号记录技术，可以用于长时间培养细胞，实时记录不同样本产生的电信号，是高通量检测神经细胞电生理特性的重要工具[48-50]。

尽管高通量技术在一定程度上可以对大量样本进行检测和分析，但大部分高通量技术由于设备成本较高，操作复杂，需借助专业技术人员，还无法实现广泛应用。但随着科技的进步，相信越来越多的高通量技术会得到进一步发展和应用，从而提高利用多能干细胞评估 DNT 的研究效率和评估准确性。

4 前景和挑战

目前，多能干细胞研究已经取得很大进展，例如，多能干细胞培养体系的不断优化，即无血清和无饲养层培养，成分更加明确，有利于实现标准化生产。另外，利用多能干细胞在体外分化形成神经细胞类型的多样性（表1）、DNT 检测指标的多样性、高通量检测技术应用等，这些在一定程度上均有助于降低研究成本，缩短 DNT 研究周期，提高预测准确性等。但利用多能干细胞进行 DNT 研究也同样面临很多问题，如干细胞培养成本较高、神经三维模型分化时间较长、对神经组织（或细胞）模型缺乏标准化的评估体系、化 学物质的暴露方式不一（浓度、作用时间等）、化学物质作用的细胞类型可能不敏感；检测体系待完善等。此外，尽管由多能干细胞分化形成的三维模型已经具备初步的结构和功能，但与人体内的神经组织相比依然存在很大差距。而且目前体外检测系统只能检测化学物质本身的毒性作用，对化学物质在体内代谢过程产生的毒性作用及体内胎盘屏障和血脑屏障的复合作用均无法在体外模拟，这将容易造成高估或者低估化学物质的 DNT[51]。总之，尽管应用多能干细胞在体外建立细胞模型研究 DNT 还存在很多不足，但随着相关技术的成熟和完善，相信多能干细胞尤其 iPSCs 在未来 DNT 体外模型应用中将发挥不可替代的作用。