玉米须中不同极性多酚体外抗氧化活性比较研究

关海宁，刁小琴，乔秀丽，李杨，刘丽美

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061）

人体在新陈代谢过程中会产生具有强氧化性的活性氧和自由基等物质，这些物质若未能及时清除，会对生物膜及细胞功能等造成损伤，进而引发衰老、心血管疾病及癌症的发生[1-2]。研究表明，抗氧化剂具有明显清除自由基的能力，进而减少其对人体的危害[3-4]。然而，由于人工合成的抗氧化剂存在安全隐患，因此，开发低毒、安全、高效的天然抗氧化剂已成为研究的热点[5-6]。近些年研究发现，酚类化合物是植物组织中广泛存在的重要的次级代谢产物，具有抗衰老、抗氧化、抗炎症、抗癌、抗肿瘤和抗心血管疾病等多种生理功能[7-9]，从而引起了国内外研究者极大的兴趣。目前，关于多酚抗氧化活性研究中存在的主要问题是提取物纯度较低，强效多酚含量较少，有相关研究表明[10-12]不同极性的溶剂可以实现不同极性多酚的提取分离，从而筛选出强效多酚。

玉米须来源丰富、价格低廉、含有多糖、多酚、黄酮、绿原酸等多种活性成分，作为药用资源具有广阔的发展前景。试验采用不同极性溶剂对玉米须多酚粗提液进行分离，并通过5 种抗氧化体系对不同极性玉米须多酚进行了抗氧化活性比较，并且分析了总多酚含量与5 种抗氧化检测方法的相关性，该研究为开发天然无毒的抗氧化剂提供了理论参考，对玉米副产物的综合开发利用奠定了理论基础和实践经验。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

玉米须：采自绥化市田间，干燥，粉碎，过30 目筛，备用。

没食子酸标准品（含量：99%）：天津市光复精细化工研究所；福林酚试剂：国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Free Radical，DPPH）（分析纯）：美国 sigma 公司；2，2-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）[Diammoni um 2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS]：湖南汇百特生物科技有限公司；乙酸乙酯（分析纯）：无锡市晶科化工有限公司；石油醚（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；氯仿（分析纯）：天津市康科德科技有限公司；正丁醇（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器及设备

TU-1901 双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-200VDE 双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；85-2 数显恒温磁力搅拌器：上海梅香仪器有限公司；RE-52A 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；80-2B 台式离心机：湖南星科科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 不同极性玉米须多酚的提取分离

称取玉米须样品5 g，加50 %的乙醇，料液比1 ∶20（g/mL），于超声温度 50 ℃、超声功率 200 W 的条件下超声提取30 min，离心（或抽滤）得滤液，滤渣重复提取2 次，合并滤液，减压蒸干，定容至25 mL，即为玉米须多酚粗提物。

向25 mL 多酚粗提液中加入等体积的石油醚，磁力搅拌30 min 后，于分液漏斗中分层，得石油醚层和水层；在水层中加入等体积的氯仿，得氯仿层和水层；利用上述方法，在水层中依次加入等体积乙酸乙酯和正丁醇，分别得到乙酸乙酯层，正丁醇层和水层。每种溶剂萃取各重复3 次，合并各极性部位的萃取液，石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层分别利用旋转蒸发器进行减压浓缩去除有机溶剂，减压后不同极性萃取物加50%乙醇定容至25 mL，备用。

1.3.2 不同极性多酚含量的测定

采用福林酚比色法测定[13]，以没食子酸为标准品，在最大吸收波长760 nm 处测不同浓度标准品的吸光度，制作标准曲线。取1 mL 不同极性的萃取物，在同样的条件下测定不同样品的吸光度值，计算各极性萃取物中多酚的含量，结果以各极性萃取物中含有相当没食子酸的毫克数表示（mg/g）。

1.3.3 抗氧化能力的测定

还原能力的测定，采用吸光值法[14]；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基清除能力的测定，参照Atoui等[15]的方法；超氧自由基清除能力的测定，参照Xiang等[16]的方法；羟自由基清除能力的测定参照Chen 等[17]的方法；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除能力的测定，参照Re 等[18]的方法测定。

1.3.4 数据处理与相关性分析

所有试验均重复3 次，计算结果以均值±标准差表示，采用Excel 2010 作图，差异显著性分析采用Statistix 8.0 软件及相关性分析采用SPSS 软件进行。

2 结果与分析

2.1 玉米须多酚含量的测定

2.1.1 没食子酸标准曲线的绘制

没食子酸标准曲线见图1。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

以没食子酸浓度（μg/mL）对吸光度y 进行线性回归，线性回归方程为y=0.117 1x+0.041 4，相关系数R2=0.996 1，由图可知，线性相关性良好。

2.1.2 不同极性玉米须多酚的含量

溶剂萃取法是一种分级纯化方法，根据溶剂与提取物极性相似相溶的原理，将目标物从植物组织中萃取出来。玉米须中多酚成分较为复杂，采用极性不同的有机溶剂可以将不同极性的多酚萃取分离，结果见表1。

表1 不同极性玉米须多酚的含量Table 1 Phenolic contents of corn silk with different polarities

表1 看出，溶剂极性的变化对总酚含量影响较大，水层的总酚含量显著高于其它有机层（p<0.05），而非极性溶剂石油醚层的总酚含量最低，说明玉米须多酚以极性酚为主，极性酚与弱极性酚含量具有显著差异（p<0.05）。也有研究也表明地参多酚和红枣多酚也均以极性酚为主[6，12]，这与本研究的结果相一致。食品功能成分研究的关键不是提取出更多的成分，而是得到更多具有高活性的功能成分。因此在采用不同极性溶剂分离多酚的同时，还应考虑各极性酚的抗氧化活性，便于后续具有强抗氧化多酚的分离纯化。

2.2 不同极性相提取物抗氧化活性分析

2.2.1 不同极性多酚的还原能力比较

还原力的测定是评价化合物抗氧化能力的一个重要指标，还原力越强，抗氧化能力越强。不同极性多酚的还原能力见图2。

图2 看出，不同极性的多酚，其还原能力各不相同。其中，水层相的还原能力最强，显著高于其他溶剂的提取物（p<0.05），而非极性的石油醚层的还原能力显著低于其他溶剂的提取物（p<0.05），说明玉米须中极性酚的抗氧化能力较强。

2.2.2 不同极性多酚的DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基是测定样品具有抗氧化作用的一种稳定的自由基，若其能被待测物清除，则说明该待测物具有打断脂质过氧化链反应的能力[19]，清除率越高，抗氧化能力越强。不同极性多酚的DPPH 自由基清除能力见图3。

图2 不同极性多酚的还原能力Fig.2 Reducing ability of corn silk polyphenols with different polarities

图3 不同极性多酚的DPPH 自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging ability of corn silk polyphenols with different polarities

图3 可知，随着萃取溶剂极性的增强，提取物的DPPH 自由基清除能力显著增强（p<0.05），其中水层DPPH 自由基清除率达到82.3%，其次为正丁醇层，而乙酸乙酯层相对较弱，石油醚层最弱，清除能力只有17.8%。由此可知玉米须多酚水层提取物对DPPH 自由基具有很强的清除作用，这与还原能力的顺序一致。

2.2.3 不同极性多酚的超氧自由基清除能力

超氧自由基是生命体代谢过程中产生的一种氧化能力较强的自由基，能够加快人体衰老进程，诱发各种疾病，危害人体健康。不同极性玉米多酚的超氧自由基的清除能力见图4。

图4 可知，水层对超氧自由基的清除能力最强，清除率达到52.4%，正丁醇次之为36.4%，乙酸乙酯层与氯仿层分别为23.8%和20.0%，而石油醚层最弱，清除能力仅为水层的25%。由此可见，不同极性多酚的超氧自由基的清除能力与极性呈正相关。

图4 不同极性多酚的超氧自由基清除能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging ability of corn silk polyphenols with different polarities

2.2.4 不同极性多酚的羟基自由基清除能力

羟基自由基是一种活性氧自由基，具有极强的氧化能力。人体内若有较多的羟基自由基，容易引发组织细胞病变，各种疾病的发生以及加速机体的衰老，因此对羟基自由基的清除作用是评价抗氧化物质能力高低的一个重要指标。不同极性多酚的羟自由基清除能力见图5。

图5 不同极性多酚的羟自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging ability of corn silk polyphenols with different polarities

图5 看出，不同极性溶剂的玉米须提取液对羟基自由基的清除率有显著差异（p<0.05）。极性强的溶剂清除率高，极性弱的溶剂清除率低，非极性的溶剂清除率最低。水层的羟基自由基清除率为69.57%，其次是正丁醇层为60.12%，而乙酸乙酯层与氯仿层显著低于水层和正丁醇层（p<0.05），但二者抗氧化能力相当。非极性石油醚层的羟基自由基清除能力最弱，与上述DPPH 自由基清除能力、超氧自由基清除能力研究结果基本一致。

2.2.5 不同极性多酚的ABTS+自由基清除能力比较

ABTS 是一种供氢体，它与过硫酸钾反应生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+·，清除ABTS+·的方法被作为一种测定物质体外抗氧化能力的新方法。不同极性多酚的ABTS+自由基清除能力见图6。

图6 不同极性多酚的ABTS 自由基清除能力Fig.6 ABTS radical scavenging ability of corn silk polyphenols with different polarities

图6 可以看出，水层、正丁醇层、乙酸乙酯层以及氯仿层中的极性多酚萃取物清除ABTS+自由基能力具有显著差异（p<0.05），以水层最高，为47.23%，而非极性石油醚层提取物的清除能力最低，为9.5%，但与弱极性层氯仿差异不显著（p＞0.05）。

2.3 相关性分析

对玉米须不同极性多酚的酚含量与抗氧化活性进行相关性分析，结果见表2。

表2 不同极性玉米须多酚抗氧化能力的相关性分析Table 2 Correlation analysis of antioxidant activity of corn silk polyphenols with different polarities

表2 看出，总酚含量与还原力、DPPH 自由基和超氧自由基的清除能力呈显著相关性（p<0.05），而与羟基自由基和ABTS+自由基清除能力无显著的相关性，说明这两种体系中，除了多酚类物质外，提取物中还存在非酚类化合物对羟基自由基和ABTS+自由基也具有一定的清除能力。不同的抗氧化体系间，还原力与DPPH 自由基、超氧自由基、羟基自由基和ABTS+自由基的清除能力呈极显著相关性（p ＜0.01），DPPH 自由基和超氧自由基和ABTS+自由基的清除能力相关性极显著（p ＜0.01），与羟基自由基的清除能力相关性显著（p ＜0.05）。羟基自由基清除能力与ABTS 自由基清除能力间无显著相关性。综合看来，不同的抗氧化体系之间并不都呈显著正相关，这可能是由于不同检测方法的反应机理稍有差异所致。

3 结论

随着萃取溶剂极性的增加，玉米须多酚含量逐渐升高，即水层＞正丁醇层＞乙酸乙酯层＞氯仿层＞石油醚层，表明玉米须多酚中强极性多酚含量高于弱极性多酚含量。

由于不同抗氧化检测方法的反应机理不同，为获得较为准确的结果，本研究利用还原力、DPPH 自由基清除法、羟基自由基清除法、超氧自由基清除法、ABTS+自由基清除法对不同极性溶剂萃取得到的多酚抗氧化能力进行了比较。5 种评价体系得出不同极性的多酚，抗氧化活性表现出一定的差异，这可能由于不同极性溶剂提取物中起抗氧化作用物质的结构和性质不同[20]，但抗氧化能力的顺序一致，即水层＞正丁醇层＞乙酸乙酯层＞氯仿层＞石油醚层，总体来说，水层提取物的抗氧化能力最强。为获得较高抗氧化活性的玉米须多酚，可以先除去提取物中的弱极性部位，富集抗氧化活性最强的水层多酚，这可为高抗氧化活性多酚的组成分析及分离鉴定奠定基础。