QuEChERS结合UPLC-MS/MS测定菠菜中5种氨基甲酸酯类农药残留

冯婉莹， 罗 浩， 黄泽涛

(广州检验检测认证集团有限公司， 广东 广州 511447)

氨基甲酸酯是一类以甲酸酯为前体化合物合成得到的农药，在我国农产品行业中应用广泛[1]。氨基甲酸酯除杀虫外，还具有促进作物生长的效果[2]，因此容易被滥用。而氨基甲酸酯毒性大，且缺乏选择性，会对人类和动物健康及水生系统构成威胁[3]。相关研究表明，氨基甲酸酯会对外周和中枢神经系统，肌肉、肝脏、胰腺和脑等器官造成影响[4]。

目前，对氨基甲酸酯类农药的测定方法主要有气相色谱法[5]、液相色谱法[6-7]、气相色谱- 质谱法[8-9]和液相色谱- 串联质谱法[10-13]，还有酶抑制法和免疫法[14-15]。气相色谱法试剂用量大，且需要浓缩，操作烦琐，不利于大批量检测。液相色谱法检测限高，或需要进行衍生，同样不适用于日常检测。气相色谱- 质谱法对热不稳定的化合物检测难度大。而酶抑制测定和免疫测定则存在实验影响因素多和检测成本高等问题。文章基于QuEChERS技术建立了测定菠菜中5种氨基甲酸酯类农药的超高效液相色谱- 串联质谱法(UPLC- MS/MS)，该方法操作简便、快速高效且回收率高、重现性好，适用于实验室的日常分析测定，为相关检测方法的研究提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氨基甲酸酯标准品(霜霉威、灭多威、异丙威、抗蚜威、丁硫克百威)，质量浓度均为1 000 mg/L，上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈、甲酸(色谱纯)，美国Fisher公司；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18固相吸附剂，安捷伦科技公司；无水硫酸镁、氯化钠(分析纯)，广州化学试剂厂。实验用水为经Milli- Q型净化系统过滤的超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm。

1.2 仪器与设备

安捷伦1200型高效液相色谱- 三重四极杆串联质谱仪，美国AB公司；Heidolph Multi Reax型涡旋振荡器，德国Heidolph公司；TGL- 16MH2050R型高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；Milli- Q型超纯水装置，美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1标准溶液的配制

分别取0.1 mL 1 000 mg/L的氨基甲酸酯标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，得到10 mg/L的标准中间液。取适量10 mg/L标准中间液用空白基质溶液稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的基质工作液，空白基质溶液由5种氨基甲酸酯呈阴性的样品处理后得到。

1.3.2样品前处理

提取：称取5 g均质后的样品于50 mL离心管，加入10 mL水和10 mL乙腈，涡旋混匀1 min，加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，涡旋提取5 min，10 000 r/min离心5 min。

QuEChERS净化：称取PSA 固相吸附剂200 mg和无水硫酸镁50 mg于1.5 mL离心管中，加入上清液1 mL，涡旋2 min，12 000 r/min离心5 min，过0.22 μm有机滤膜后待UPLC- MS/MS测定。

1.4 色谱及质谱条件

1.4.1色谱条件

色谱柱：Agilent Proshell C18(150 mm×3.0 mm，2.7 μm)；流动相A：乙腈；流动相B：体积分数0.1%甲酸；流速：0.4 mL/min；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；等度洗脱，流动相组分比例A∶B为75∶25。

1.4.2质谱条件

扫描方式：电喷雾电离源(ESI+)；气帘气：25 psi；电离电压：5 500 V；离子源温度：500 ℃；雾化气：50 psi；加热辅助气：50 psi；碰撞气：medium；采集模式：多反应监测(multi-reaction monitoring, MRM)模式。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

由于5种氨基甲酸酯农药含有胺基结构，属于亲核型化合物。因此，实验对比了乙腈- 水和乙腈- 0.1%甲酸流动相对5种目标物响应值的影响。结果发现，以乙腈- 0.1%甲酸作为流动相，5种目标物在电离源中能更好地离子化，响应值更高。同时调整了洗脱梯度对5种氨基甲酸酯进行分离，但由于异丙威和抗蚜威极性相近，使用梯度洗脱仍难以使2种化合物分离。而5种氨基甲酸酯的母离子均不一样，因此，最终采用等度流动相进行洗脱。当水相超过25%时，5种氨基甲酸酯出峰时间均延后，丁硫克百威峰型变宽，所以最终使用流动相为乙腈- 0.1%甲酸(体积比75∶25)。5种氨基甲酸酯MRM色谱图见图1。

图1 5种氨基甲酸酯的MRM色谱Fig.1 MRM chromatograms of five carbamate pesticides

2.2 质谱分析参数的优化

由于5种氨基甲酸酯农药呈弱碱性，在电喷雾正离子模式下形成的准分子离子峰中[M+H]+丰度最高。以流动注射的方式在电喷雾正离子模式下，对母离子进行二级质谱扫描，选择丰度较高的2个碎片离子作为定量和定性离子，通过MRM模式分别优化各个离子对的去簇电压(DP)和碰撞电压(CE)等参数条件，以达到检测的最佳灵敏度(见表1)。

2.3 乙腈用量对回收率的影响

实验前期优化时发现，涡旋振摇1 min以上基本可完成提取，因此不对提取时间详细探究；而在纯水用量10 mL条件下，探究乙腈用量对回收率的影响，见图2。结果发现，当乙腈用量为10 mL时，5种氨基甲酸酯的回收率基本满足测定要求；用量继续增加，回收率无明显变化。考虑到稀释倍数越大，方法检出限越高，因此选取10 mL为乙腈提取用量。

表1 5种氨基甲酸酯的质谱分析参数

*为定量离子。

图2 乙腈用量与回收率的关系Fig.2 Relationship between acetonitrile dosages and recovery rates

2.4 PSA用量对回收率的影响

菠菜样品中含有的大量天然色素和其他极性较大的杂质对5种氨基甲酸酯有较大的基质效应影响。实验采用PSA、GCB和C18固相吸附剂对处理后的溶液进行净化。结果发现，GCB对5种氨基甲酸酯有较明显的吸附作用，导致回收率降低，其次是C18。PSA对5种氨基甲酸酯的吸附较少，且能较好地去除基质效应，最终选取PSA进行净化；但基质效应仍较明显，导致回收率只有40%～50%，因此也需要采用空白基质曲线进行校准。优化后选取PSA用量为200 mg，见图3。

图3 PSA用量与回收率的关系Fig.3 Relationship between PSA dosages and recovery rates

2.5 线性关系、检出限和定量限分析

采用外标法对5种目标物进行定量，将空白基质溶液配制的标准溶液按优化后的仪器条件进行测定。以质量浓度为横坐标(X)，定量离子对峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归分析，所得方程见表2，相关系数r均大于0.999 1。结果表明，5种目标物在给定的范围内呈良好线性关系，以信噪比RS/N=3和RS/N=10分别计算出方法检出限(LOD)和方法定量限(LOQ)，异丙威和丁硫克百威分别为0.20 μg/kg和0.50 μg/kg，其他3种化合物分别为0.10 μg/kg和0.25 μg/kg，表明方法灵敏度达到分析测定要求。

表2 5种氨基甲酸酯线性方程、相关系数和检出限

2.6 精密度、回收率及重复性分析

选用阴性样品，以定量限的1、2、10倍进行3个水平的加标回收实验，每个加标水平分别日内进行6次平行测定。菠菜样品的平均回收率范围在91.0%～101.0%，相对标准偏差RSD在2.15%～5.57%(见表3)。说明方法回收率高，重现性好，能满足分析测定要求。

表3 5种氨基甲酸酯的回收率和精密度

3 结 论

研究基于QuEChERS技术结合UPLC- MS/MS，建立了菠菜中5种氨基甲酸酯的测定方法。利用PSA对样品提取液进行净化，有效地降低了基质效应对回收率的影响，大大提高了方法灵敏度。优化超高效液相色谱条件后，5种氨基甲酸酯在9 min内出峰，且峰型良好。使用空白基质曲线进行校正，根据相关方法学实验结果表明，实验所用方法简单便捷，回收率高且精密度高，为氨基甲酸酯类农药残留量的检测研究提供了参考。