小麦苗期钾效率相关性状的全基因组关联分析

张艳霞，赵艳艳，郭 营，赵 岩，李斯深，孔凡美

（山东农业大学作物生物学国家重点实验室/土肥资源高效利用国家工程实验室，山东泰安 271018）

小麦是我国第三大粮食作物，钾是小麦必需的营养元素，其直接影响小麦的产量与品质。已有的研究表明，施钾可以提高小麦产量、改善籽粒品质[1-4]，提高其抗旱性[5]，并显著影响其他营养元素的吸收[6-7]。小麦生产需要大量的钾，每生产100 kg小麦籽粒需要吸收K2O 5.82 kg[8]，但我国钾肥资源短缺，钾肥进口依赖度超过50%，钾肥施用成本很高。实际上，作为小麦主产区，我国北方土壤中全钾含量高达2.1%，每亩地0—20 cm土层的钾储存量高达1000 kg，但是对植物潜在的有效钾仅占全钾量的1%～2%[9]。如何充分利用土壤中的钾已成为关注的焦点问题。刘国栋等[10]最先提出，从事植物生理、植物营养、生物化学、植物遗传和作物育种等的科学工作者应加强横向联合，对我国丰富的种质资源进行比较、筛选，探明耐低钾的机理和调控途径，培育和推广钾高效基因型品种，从而缓解我国钾资源短缺的问题，进而降低农业生产成本，提高经济效益。而探明小麦钾效率相关基因分子标记，可通过分子标记辅助选择实现钾高效小麦品种的定向改良与培育[11]。本文以黄淮麦区134份小麦品种 (系) 组成的自然群体为材料，设置低钾和正常供钾两个处理，对小麦苗期钾效率相关性状进行鉴定，以该群体检测到的15230个差异SNP标记为基础，在群体结构分析的基础上，对钾效率相关性状进行关联分析，以期获得与小麦钾效率紧密关联的分子标记位点，为小麦钾效率相关基因的深度挖掘和遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以134份小麦品种 (系) 为供试材料，包括66个山东品种、24个河北品种、16个河南品种、14个陕西品种、8个山西品种、2个江苏品种、2个四川品种、1个澳大利亚品种和1个加拿大品种(表1)。通过对该群体的9万个SNP标记差异性检验，共筛选出有差异的SNP位点15230个，为钾效率性状关联分析提供了分子标记数据基础。

1.2 试验设计与实施

试验于2014年12月10日—2015年1月17日(E1) 和2015年3月5日—4月12日 (E2) 在山东农业大学温室进行。采用营养液培养，正常营养液配方：大量营养元素，KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2(NH4)2SO4·H2O 和 Ca(NO3)2·4H2O，浓度分别为0.2、0.5、1.8、1.5、1.0 mmol/L；微量元素，H3BO3、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O 和 Fe·EDTA，浓度分别为1、0.1、0.5、1.0、1.0 和 100 μmol/L。设置正常钾(T1，K 2.0 mmol/L) 和低钾 (T2，K 0.2 mmol/L) 两个处理，2014、2015年两个试验处理依次记为T1E1、T2E1、T1E2、T2E2，每个处理3次重复。

images/BZ_7_272_286_2179_3169.png

将134份供试小麦品种 (系) 的种子用10%的H2O2消毒5分钟后萌发，幼苗长至约7 cm高 (7天)后选择长势一致的幼苗 (每个材料移苗3株) 转移至专用穴盘中，将整个穴盘置于容积为20升的黑色塑料盒中，营养液每隔3天更换一次，期间用NaOH或HCl调节pH值至6.0～6.2，24小时通气。2014年试验期间温度为5.8～28.6℃，湿度8.6%～85.9%，光照强度0～57.8 klx，移苗并进行营养液处理后28天收获；2015年试验期间温度为7.5～33.9℃，湿度10.1%～91.3%，光照强度0～69.0，移苗并进行营养液处理后28天收获。

1.3 相关指标测定方法

植株干重：根系和地上部在105℃烘干后，用1/1000天平称重；

植株样品钾含量采用H2SO4-H2O2消解，火焰光度法测定；

钾积累量为相应部位的钾含量与其生物量的乘积；

钾利用效率为单位含量的养分支撑的生物量 (钾利用效率 = 生物量/该部位钾含量)[12]。

1.4 数据统计

利用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析，Powermarker 3.25软件[13]分析等位变异数并计算多态性信息含量，Structure 2.3.1软件对供试材料进行群体结构分析，估测群体结构，并计算材料相应的Q值[14]。估计最佳群体数K，其取值范围为1～15，将MCMC(Markov Chain Monte Carlo) 开始时的不作数迭代 (length of burn-in period) 设为50000 次，再将不作数迭代后的MCMC设为100000次，每个K值重复运行5次，依据似然值最大的原则选取合适的K值作为群体数目[15]。利用TASSEL 5.0软件中的GLM模型和MLM模型结合分子标记数据、群体结构数据和钾效率相关性状数据进行标记—性状的关联分析，确定关联位点。

2 结果与分析

2.1 小麦苗期钾效率相关性状表型变异及关联分析

在两次重复试验环境中，与正常钾处理相比，低钾处理条件下供试群体134份小麦品种苗期生物量及钾效率相关性状均表现出显著差异。低钾处理下，根、冠及全株钾含量和钾积累量均显著下降，而根生物量及根、冠、全株钾效率均显著增加。各供试性状在两次试验间均表现出显著差异。例如，2015年的全株生物量、全株钾累积量及钾利用效率均显著高于2014年，这可能与钾处理之外的光照、温度以及湿度的差异有关。

此外，134份小麦品种生物量及钾效率相关性状也表现出显著的基因型差异。表2显示，群体地上部钾含量变异系数为6.23%，根系钾积累量变异系数为43.57%。群体各性状均表现出连续变异，是典型的数量性状，遗传率变幅为5.96%(根系钾含量)～57.9%(根系干重)。

将两次试验中的相同处理取平均值然后进行性状间的相关性分析，结果表明，除了根系干重与根系钾含量，植株总钾含量与生物量性状，钾累积量冠比与其它性状，生物量根冠比与其它性状及浓度性状与钾效率性状的关系呈显著负相关或不相关，苗期小麦钾养分效率相关性状间呈极显著相关 (表3)。

2.2 小麦苗期钾效率相关性状显著关联的稳定位点

小麦苗期试验共调查了14个性状，分别对两次试验不同环境下处理的性状 (56个) 以及同一性状两种环境下相同处理的平均值 (28个) 进行了关联分析，共获得显著关联分子标记1300个，其中1102个标记被定位在除4D、7D以外的19条染色体上 (表4)。14个性状分别定位了27～136个显著关联的分子标记位点，贡献率7.46%～22.6%。有135个标记在至少两种处理环境 (包含平均值) 中被检测到与同一性状显著关联 (稳定关联标记)。其中，在3种环境下(包括平均值) 均检测到稳定关联位点有三个：Excalibur_c14273_1407、BS00094893_51和 Ku_c11150_773，分别与生物量根冠比、地上部钾利用效率和根系钾利用效率显著关联。其中与根系钾利用效率稳定关联的Ku_c11150_773贡献率达到15.7% (表5)。

2.3 苗期生物量及钾效率相关性状簇集位点

试验筛选出同时与至少6个性状显著关联的标记4个，分别为Excalibur_c8670_972、Excalibur_c115824_267、wsnp_Ku_c13311_21255428、IACX-5989，分别定位于6D、3B、3B、4B染色体上，贡献率8.43%～12.57% (表6)。

3 讨论

3.1 低钾对小麦苗期钾效率相关性状的影响

大量研究表明，钾胁迫会限制植物生长，降低生物量[16-18]。本研究在两次低钾胁迫环境下，小麦苗期地上部干重、植株总干重显著下降，根系干重下降不明显，生物量根冠比在低钾胁迫环境下显著增加，这些研究结果与梁雪等[19]和Kong等[20]的研究结果一致。这表明为了适应低钾胁迫环境，增加对钾养分的吸收和利用，小麦会增加碳水化合物在根系中的分配，从而使根冠比增加。低钾处理下苗期小麦植株钾的累积量均显著下降，但钾利用效率均显著增加。

表 2 供试小麦群体苗期钾效率相关性状的表型变异Table 2 Phenotypic variation of K efficiency related traits of wheat at seedling stage for tested materials

续表 2 Table 2 continued

表 3 苗期小麦钾效率相关性状间的相关性Table 3 Correlation coefficients among K efficiency related traits of wheat at seedling stage

表 4 小麦苗期性状显著关联位点数量及其对表型变异的解释率Table 4 Loci associated seedling traits and the phenotypic variations explained by them

3.2 与钾效率相关的性状间的相互关系

钾效率是一个非常复杂的性状，对钾高效基因型的性状表现已有大量研究，但到目前为止，钾效率仍然没有公认的评价指标。一般认为，植物钾素效率包含相互关联的两个方面，一是植物从土壤里吸收钾素的效率 (吸收效率)；二是植物利用吸收的钾素获得产量的效率 (利用效率)。从植物角度讲，吸收效率也就是在相同钾供应强度下植物吸收累积钾的能力，吸收累积量大的钾吸收效率高，而利用效率是植物体内单位养分累积量产生的干物质量 (养分含量的倒数)。实际上，单一养分高效吸收和利用均不一定意味着高干物质产量[21-22]。因此，有研究采用生物量与养分利用效率的乘积来评价养分效率[12]。可见，养分效率是一个十分复杂的性状，是植物体内众多基因协调作用的综合结果。因此，Yang等[23]认为钾效率是植物在中度供钾和缺钾的条件下，通过内部和外部的一些利用机制，获得更高干物质产量和 (或) 谷物产量的能力。众多的养分效率指标的计算和评价都要用到生物量和养分含量，然后计算养分累积量、养分利用效率。这些指标之间均存在显著的内在联系，在遗传控制上往往表现出复杂的交叉控制，也就是说不同的性状可能由相同基因控制，同时也必然存在不同基因的调控。因此，做关联分析时选用所有与钾养分效率相关的性状进行分析，也可以在一定程度上反映和探讨性状间的遗传

控制关系。

表 5 小麦苗期钾效率相关性状稳定关联标记位点Table 5 The environmental stable markers which associated with seedling K efficiency related traits

表 6 小麦苗期钾效率相关性状簇集位点Table 6 The marker locations where K efficiency related traits clustered

3.3 小麦苗期钾效率相关性状的关联分析及关联位点

关联分析是目前人们研究植物性状遗传学的重要方法。赖勇等[24]用86个SSR标记与113份大麦材料的农艺性状进行关联分析，郭志军等[25]用74个SSR标记与172份陆地棉栽培种的农艺性状进行关联分析；陈甲法[26]用166个SNP与玉米穗粒腐病抗性进行关联分析。本研究以134份小麦品种 (系) 组成的自然群体为研究材料，利用该群体的15230个差异SNP标记与苗期钾效率相关性状进行关联分析，群体多样性强，遗传多样性丰富。此外，本研究利用全基因组SNP标记对正常钾和低钾处理下小麦苗期钾效率相关性状进行GWAS分析，采用GLM一般线性回归和MLM混合线性模型相结合的方法，并且采用的阈值较高 (P≤ 0.001)，可有效消除由群体分层和亲缘关系引起的伪关联，增加关联结果的可信度。

尽管目前在小麦上的关联分析研究已有大量报道，但是针对于小麦养分效率尤其是钾效率方面的关联分析罕见报道。利用遗传群体进行QTL分析也可获得与目标性状遗传控制有关的分子标记位点/基因。小麦钾养分效率相关性状的QTL分析已有部分报道，也获得了一些相关分子标记位点。例如，Guo等[27]采用液培法，设置不同的氮、磷、钾处理，利用“山农483 × 川35050”群体定位到了380个与小麦苗期氮、磷、钾效率相关性状有关的QTL；Xu等[28]利用小麦双单体 (DH) 群体在钾胁迫的液培条件下定位了65个小麦苗期钾、钠、镁浓度相关性状的QTL；宫晓平[29]利用“鲁麦21 × 山农0431”群体在钾胁迫下定位了114个小麦钾效率相关性状的QTL。这些研究结果表明，与钾效率相关性状有关的分子标记位点环境稳定性均较差，绝大多数QTL仅在特定环境中被检测到，但是也检测到一些环境稳定性较好的分子标记位点。这与本研究的结果相似。本研究利用小麦自然群体，在不同钾处理下检测到了1300个SNP标记与苗期钾效率相关性状(包括生物量) 显著关联，其中仅有137个标记在至少两个环境 (包括均值) 中与同一性状稳定关联，其中至少3个环境下与同一性状稳定关联标记有3个，分别为Excalibur_c14273_1407、Ku_c11150_773、BS00094893_51，分别与生物量根冠比、地上部钾利用效率和根 系钾利用效率显著关联，其中地上部钾利用效率的显著关联位点在第一次试验 (环境E1) 中的两个钾处理下均检测到，而根系钾利用效率显著关联标记在CK处理两次试验 (环境E1、E2) 中均检测到。这些相对稳定的位点贡献率较小，仅为7.46%～22.63%。试验检测到的所有显著关联分子标记位点的平均贡献率为10.87%，这些标记位点在本试验设置的处理/环境中绝大多数 (84.77%) 仅被检测到一次，这些结果表明钾效率相关性状是一个极为复杂的数量性状，可能由众多微效基因控制，且受环境影响显著。试验检测到的所有的分子标记与前人检测到的QTL或分子标记均不相同。试验环境处理、供试群体基因组差异都是导致与前人结果不同的重要原因。

另外，小麦苗期试验还筛选出4个性状簇集位点标记，分别为Excalibur_c8670_972、Excalibur_c115824_267、wsnp_Ku_c13311_21255428和IACX5989，这些标记均与至少6个性状显著关联。主要有地上部干重、植株总干重、地上部钾累积量、植株总钾累积量、地上部钾利用效率、植株总钾利用效率、根系干重、根系钾累积量相关性状，且根据性状之间的相关性可知，这8个性状均在P＜0.01的水平上极显著相关。其中所有簇集位点均与地上部干重、植株总干重、植株总钾累积量、植株总钾利用效率这四个性状显著关联。另外，在一些钾高效和低效品种的表型数据中，也验证了这种关联性。例如，钾低效品种临抗16号和周99233，在低钾处理下生物量与钾效率相关性状均显著降低；而钾高效品种澳大利亚红麦和黑小麦76，低钾处理条件下的生物量与钾效率相关性状均显著提高。这表明同一位点可能同时与多个性状显著关联。许多养分效率性状QTL分析结果也表明，在染色体上存在着热点QTL区域[27,29-30]。张国华等[31]研究结果也显示了多个性状的相互关联现象，这种现象可能是控制这些性状的QTL相互连锁或是由于某个QTL的一因多效引起的。同一标记与多个相关性状的关联可用于解释数量性状之间可能存在的遗传相关。这些控制小麦钾效率的高频表达位点和性状簇集位点可能对小麦苗期生长发育的钾效率有重要的调控作用，值得深入探讨。

4 结论

不同钾处理对小麦苗期钾效率相关性状及其显著关联分子标记位点均有显著影响。低钾处理显著降低小麦苗期生物量，但生物量根冠比和钾利用效率显著增加；绝大多数与苗期钾效率相关性状关联的分子标记仅在一个钾处理环境中出现，环境稳定性较差。有4个分子标记位点，包括Excalibur_c8670_972、Excalibur_c115824_267、wsnp_Ku_c13311_21255428和IACX5989，同时与至少6个性状显著关联，是苗期钾效率相关性状遗传控制的热点位点，值得深入研究。