大鼠外周血嗜中性粒细胞分离方法的优化改良

王 芸 ,李春晓 ,孙向婉 ,王 鑫 ,赵正午 ,王月明 ,韦东来,刘晓晔,穆 祥,董 虹

[1.北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京昌平102206 ;2.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193]

嗜中性粒细胞[1](PMNs)是多形核白细胞的一种,在骨髓中形成待发育成熟后进入血液循环,是机体的固有免疫细胞,参与机体的免疫反应和增强机体的防御作用,其在抵御病原体,控制炎症发生中发挥重要的作用。目前动物细菌性疾病是畜牧业的难点,许多研究表明,PMNs 在细菌引起的一些的免疫反应及炎症等中扮演了重要的角色。近年来对PMNs 的研究越来越多,随着研究的不断深入,提取较纯的PMNs 成为试验的关键步骤。在大多数肉食性动物中,PMNs 占血液白细胞总数的60%～75%,而在牛、绵羊及实验用动物(如大鼠)中仅占20%～30%[1]。以往的研究中分离的大多是人、狗、兔血液中的PMNs,由于这些动物白细胞中的PMNs 比率较大,因此以常规方法分离后,即可获得较高纯度的PMNs。但基础研究中,大鼠是较为常用的实验动物,而大鼠白细胞中的PMNs 比率较低,甚至不到人血的一半,用常规方法提取PMNs 的方法分离大鼠PMNs 获得率较低。

目前从大鼠外周血中分离PMNs 的方法并不成熟,仍以密度梯度离心法为主,主要是利用一种密度介于PMNs 与其他细胞之间而近于等渗的溶液(分层液)做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,从而将PMNs 从外周血中加以分离[2]。其中常用的分层液为Percoll,因为Percoll 扩散常数低,所形成的梯度十分稳定,此外,Percoll 不穿透生物膜,对细胞无毒害,还可将受损的细胞及其碎片与完好的活细胞分离,因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒[3-5]。虽然Percoll 密度梯度离心法能提取出PMNs,但获得的PMNs 纯度却不高,存在较多杂细胞,也有人利用免疫方法如流式分选或者免疫磁珠法进行纯化,但成本较高且费时[6]。因此,本试验在常规Percoll 密度梯度提取方法[7-10]的基础上进行改良,以期获得数量较多、纯度较高、活性较好的PMNs,为后期试验研究提供细胞材料。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD 大鼠10 只,雄性,体重200～300 g,由中国人民解放军军事科学院实验动物中心提供[SPF 级,动物合格证号:SCXK(军)2012-0004]。

1.2 仪器与试剂 超净工作台(哈尔滨东联电子技术开发有限公司,型号:DL-CF-IND) ;CO2培养箱(SANYO,型号:MC0217AC);细胞计数板(浙江玉环求精医用仪器,批号:XB-K-25)。

Dextran T-500(批号:17032001)购自Pharmacia公司;Percoll(批号:170891-01)购自GE Healthcare公司;PE Mouse Anti-Rat CD11b/c(批号:E15919-105)和APC Mouse Anti-Rat CD172a(批号:E24465-101)购自BD 公司;RPMI-1640(批号:11875-093)和FBS(批号:1616964)购自Gibco 公司;1 × PBS(批号:P1020)、红细胞裂解液(批号:R1010-100)、大鼠外周血淋巴细胞分离液(批号:P8360),均购自Solarbio 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 常规方法对PMNs 的提取[10]SD 大鼠心脏采血20 mL 左右,将血液与4% Dextran-T500/PBS 4:1 混合,4 ℃静置60 min。取上层白细胞悬液,将白细胞悬液以等体积轻铺在两层Percoll 界面上(Percoll 柱:2 mL 75% Percoll +2 mL 45% Percoll),水平转子700 g 室温下离心45 min。用巴氏吸管吸取两层percoll 中间的细胞层,并将其与PBS等体积混合,450 g 室温下离心10 min(若沉淀有红细胞,则用红细胞裂解液将残余的红细胞除去)。离心后得到的沉淀即为PMNs,将提取出的PMNs 于10% RPMI-1640 培养基中培养至少15 min。

1.3.2 优化改良后方法对PMNs 的提取 白细胞悬液制备方法同1.3.1,预先将大鼠外周血淋巴细胞分离液加在试管底部,再缓慢加入白细胞悬液,水平转子700 g 室温离心25 min,弃上清后加入AKC 缓冲液5 mL 并轻轻吹匀,400 g 室温离心5 min。向离心得到的沉淀中加入分离液(含2%FBS 的RPMI 1640)5 mL,洗2 遍,400 g 室温离心5 min。用6 mL 45% Percoll 轻轻重悬细胞,然后加入预先准备好的81%和62% Percoll 柱(3 mL 81%Percoll+4.5 mL 62%Percoll)中离心。1 500 g 4 ℃离心30 min。取大概在3～5 mL 处的云雾状细胞2 mL,加入5 mL 分离液,1 200 g 4 ℃离心5 min。用含10% FBS 的RPMI 1640 重悬提取出的PMNs,培养至少15 min。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 PMNs 细胞数量检测 从分离得到的PMNs混悬液中取出50 μL,用血细胞计数板于显微镜下计数分离后PMNs 数量[11-12]。

1.4.2 PMNs 细胞活力检测 取10 μL 分离得到的PMNs 混悬液进行台盼蓝染色镜检[11-12]。计数所有细胞的总数,统计其中的活细胞和死细胞数目,按公式计算出PMNs 活力。PMNs 活力(%)=(活细胞数/观察的细胞总数) ×100%。

1.4.3 PMNs 细胞纯度检测 (1)姬姆萨染色:从分离得到的PMNs 混悬液中取出50 μL 推片进行姬姆萨染色镜检,显微镜下随机计数100 个细胞,计算分离得到的嗜中性粒细胞的纯度百分比。PMNs 纯度(%)=(PMNs 计数/100) ×100%。(2)流式细胞仪检测:将待测细胞用PBS 制成细胞悬液,132 g 4 ℃离心5 min,弃上清,加入PE Mouse Anti-Rat CD11b/c 或APC Mouse Anti-Rat CD172a 抗体4 ℃孵育30 min。离心后PBS 洗2 遍,用200 μL PBS 重悬后立即上机检测。

1.5 数据处理与分析 试验结果用Graphpad Prism 6 统计软件处理数据,所有数据采用均数±标准差表示。∗P<0.05、∗∗P<0.01 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PMNs 细胞数量检测 由图1 可知,改良后方法提取的PMNs 数量与常规方法相比差异显著(P<0.05),说明改良后的方法得到的PMNs 数量较多。

图1 PMNs 数量比较

2.2.2 PMNs 细胞活力检测 提取出的细胞经台盼蓝染色后,死亡的细胞着色浅蓝色并膨大,无光泽,活细胞不着色并保持正常形态,有光泽。经统计,两组细胞活性均较高无明显差异,均可达97%以上。见图2。

图2 PMNs 台盼蓝染色

2.3 PMNs 细胞纯度检测

2.3.1 姬姆萨染色 PMNs 镜下可见胞浆呈淡粉色,着色均匀,核呈深紫红色,一般可分2～5 叶,以3 叶为多。由封三彩版图3 可知,改良后方法(封三彩版图3B)提取出的大部分为PMNs,常规方法(封三彩版图3A)提取出的大部分为淋巴细胞,PMNs较少。经统计后,发现常规方法提取的PMNs 纯度约为20%,改良后提取的PMNs 纯度约为80%,说明改良后的方法提取PMNs 纯度较高。

2.3.2 流式细胞仪检测 通过流式细胞仪检测后发现提取出的细胞具有CD11b/c+(见封三彩版图4B)、CD172a+表型(见封三彩版图4C),可鉴定其为PMNs[13]。由图4 可知,改良后提取的PMNs 纯度能达到80%,而常规方法提取的PMNs 纯度只有20%,改良后方法提取的PMNs 纯度与常规方法相比差异极显著(P<0.01),此结果说明改良后的方法提取PMNs 纯度远高于常规方法。

图3 PMNs 姬姆萨染色 (×1 000)

图4 PMNs 纯度鉴定

3 讨论

PMNs 在抗菌和抗炎方面的特点使其成为国内外的研究热点,目前国内外文献[14-18]显示,分离嗜中性粒细胞的方法众多,除了本文用到的Percoll 密度梯度离心法外,还有Ficoll 方法、Dextran 作用下红细胞自然沉降法、裂解红细胞法、流式细胞仪法、免疫磁珠等方法[19-21]。Haslett 等[22]发现Ficoll 法对PMNs 形态、趋化能力,PMNs 功能等有较大影响,而Dextran 作用下红细胞自然沉降法和裂解红细胞法PMNs 获得率较低[20,23],流式细胞仪法和免疫磁珠法操作步骤复杂且成本较高,不易推广[6],因此本试验选择了应用较多的Percoll 密度梯度离心法[5],并在此基础上进行优化改良。

本试验考察了优化后提取方法对PMNs 纯度、活力和数量的影响,结果表明改良后方法和常规方法相比纯度从20%提高到了80%,约为常规方法的4 倍,数量从6.8 ×106个提高到了8.3 ×106个,约为常规方法的1.2 倍,且优化后的方法细胞活性仍然较高,达到98.33%。目前报道的文献[19-21]中所采取的从大鼠外周血中分离PMNs 的方法多因含有较多的淋巴细胞和单核细胞而导致其纯度不高,因此本试验通过加入外周血淋巴细胞分离液以去除大部分的淋巴细胞。此外有文献[24]表明即使只有0.003 g/mL 的Percoll 梯度密度变化都会对细胞群的纯度产生显著的影响,因此本试验对Percoll 密度进行优化从而提高PMNs 纯度。常规方法所用的Percoll 大多为45% 和75%,相对应的密度为1.058 g/mL 和1.090 g/mL,改良后方法所用的3 层Percoll 分别为45%、62%和81%,相对应的密度分别为1.058 g/mL、1.078 g/mL 和1.100 g/mL。而大鼠外周血PMNs 密度为1.085～1.097 g/mL,淋巴细胞密度为1.052～1.077 g/mL,单核细胞密度为1.050～1.066 g/mL[25]。若采用45%和75% Percoll进行分离,两层Percoll 中间的细胞即为PMNs,但同时淋巴细胞和单核细胞也会出现在2 层Percoll 中间,从而造成杂细胞过多,此外还会损失掉一部分密度为1.091～1.097 g/mL 的PMNs,致使最终提取出的PMNs 质量不高。改良后的提取方法采用3 层Percoll 很好的解决了这个问题,淋巴细胞和单核细胞出现在45% 和62% Percoll 之间,PMNs 则出现在62%和81%Percoll 之间,此方法能将淋巴细胞和单核细胞尽可能的去除掉,并能最大限度的保留PMNs。

除本试验中采取的常规方法外,本实验室前期还尝试过商品化的试剂盒但效果并不理想,得到的PMNs 纯度不到20%,同时根据文献报道[17]摸索过其他浓度的Percoll 及相应条件,发现PMNs 纯度均在80%左右,数量在6.0 ×106个左右,但由于其转速过高或时间过长反而会对PMNs 造成机械性损伤对其研究及应用存在一定影响,这些结果与文献[1]报道的现象一致。改良后方法可一次分离纯化并得到数量较多的PMNs,但操作时要注意温度和Percoll 柱等问题。PMNs 活性和温度[26]有密切关系,在分离过程中当某些步骤的温度超过室温时,PMNs 活性会降低,得到的细胞数量也偏低,有些重要的步骤必须在4 ℃的低温环境下进行。此外需要特别注意在制备Percoll 层时要求保护好界面,向里加入液体时也需要十分小心,动作要轻缓,一定不能破坏其分层,否则将达不到目的。

总之,本试验改进后的方法在保证了PMNs 活力的基础上提高了其纯度和数量,表明优化改良后方法分离PMNs 纯度好,数量多,且经济、简便,是一种简单、高效的较为理想的PMNs 分离方法,适于临床和科研中广泛应用,为PMNs 生物学特性及其功能的研究奠定了基础。