耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的药敏结果及耐药基因

孙 吉，何鸽飞，沈 晖，周于禄，黄娟娟，刘晓慧，谭 红

(1. 长沙市第一医院，湖南 长沙 410005； 2. 中南大学湘雅三医院，湖南 长沙 410013)

近年来，全球范围内肠杆菌科细菌尤其是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率迅速升高，2013年美国疾病控制与预防中心(CDC)将耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)列为最高级别“紧迫威胁”[1]。2014年世界卫生组织(WHO)发布的首份全球114个国家抗菌药物耐药监测报告显示，全球所有地区均已出现耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)，且有些国家超半数CRKP感染治疗无效[2]。2017年中国CHINET细菌耐药监测报告显示,肺炎克雷伯菌对美罗培南的耐药率高达23.1%，对亚胺培南的耐药率高达20%[3]。CRKP 感染的治疗是目前临床上亟待解决的医学难题，因此，本研究分析CRKP的流行特点及耐药机制，以期为临床CRKP感染的治疗提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2017年1月—2018年6月某医院微生物室分离的对厄他培南或亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌，保存至-80℃冰箱，剔除同一患者同一部位分离的重复菌株。采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪及鉴定卡对肺炎克雷伯菌进行鉴定及药敏分析。药敏试验质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.1.2 仪器与试剂 抗菌药物标准品购自中国食品药品鉴定研究院，中国蓝琼脂平板、M-H琼脂平板购自上海哈灵生物科技有限公司，VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪、细菌药敏鉴定卡，麦氏比浊仪购自法国生物梅里埃生物有限公司，SanTaq PCR Mix 预混液、基因扩增引物购自上海生工生物工程技术有限公司，琼脂糖分子量Marker DL2000、10×Loading buffer购自TaKaRa 生物工程有限公司，全自动凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.2 耐药基因检测 采用聚合酶链式反应(poly-merase chain reaction，PCR)扩增以下碳青霉烯酶基因：blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaSIM-1、blaSPM、blaGIM及blaNDM-1；OXA基因：blaOXA-48；超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases, ESBLs)基因：blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaCTX-M-2、blaCTX-M-8、blaSHV与blaTEM。采用煮沸法提取细菌DNA，PCR扩增引物序列参照文献[4]合成，扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳，采用全自动凝胶成像分析系统观察PCR 扩增产物结果，阳性扩增产物送北京华大基因研究中心进行测序，然后将测序结果与GenBank中BLAST序列进行比对。

2 结果

2.1 CRKP感染患者临床特点 2017年1月—2018年6月共收集57株CRKP，57例感染患者，其中男性30例，女性27例；年龄(73±14)岁；住院时间(81±127)d；大部分患者合并有基础疾病，主要包括高血压(32例)、糖尿病(13例)、心功能不全(30例)、肾功能不全(10例)、恶性肿瘤(3例)；APACHE评分为(11.96±5.26)分。

2.2 CRKP标本来源及病区分布情况 57株CRKP主要来源于呼吸道标本，分别为痰(34株，59.65%)、肺泡灌洗液(11株，19.30%)、咽拭子(1株，1.75%)；其次为尿(6株，10.53%)，血(2株，3.51%)，脑脊液、脓液和胆汁(各1株，各占1.75%)。来源科室主要为神经内科(20株，35.09%)、呼吸内科(15株，26.32%)、重症医学科(9株，15.79%)，其次为神经外科(5株，8.77%)、康复医学科(3株，5.26%)、肾内科(2株，3.51%)，心内科、艾滋病科、内分泌科各1株(各占1.75%)。

表1 57株CRKP对抗菌药物的耐药情况

2.4 耐药基因检测结果 57株CRKP共检出2种碳青霉烯酶基因(KPC-2、NDM-1)，4种ESBLs基因(SHV、CTX-M-9、TEM、CTX-M-1)，部分PCR扩增产物见图1、2。57株CRKP中，1株检出NDM-1基因；39株KPC-2阳性，阳性率为68.42%，其中21株同时携带SHV、CTX-M-9和TEM基因，8株同时携带SHV基因，6株同时携带SHV和CTX-M-9基因，4株同时携带SHV和TEM基因。57株菌株全部检出ESBLs基因，见表3。将1号和8号菌株扩增的PCR产物进行测序，测序后结果与BLAST中序列编号LR130548.1进行比对，一致性为99.22%。

表2不同科室分离MDR、XDR、PDR菌株数

Table2Numbers of MDR, XDR and PDR strains isolated from different departments

科室MDRXDRPDR神经内科1720呼吸内科1500重症医学科900神经外科401康复医学科300肾内科200心内科100艾滋病科100内分泌科100合计5321

表357株CRKP菌株ESBLs基因检出情况

Table3Detection resuts of ESBLs genes of 57 strains of CRKP

基因类型阳性菌株数阳性率(%)SHV+CTX-M-9+TEM2543.86SHV+ CTX-M-91424.56SHV+TEM58.77TEM+CTX-M-123.51SHV1119.30合计57100.00

M:分子量标准；1、2、3分别为KPC阳性株、阴性对照、阳性对照；4、5、6分别为NDM-1阳性株、阴性对照、阳性对照；7、8、9分别为TEM阳性株、阴性对照、阳性对照

图1碳青霉烯酶基因PCR扩增产物电泳图

Figure1Electrophoresis map of PCR amplification produ-cts of carbapenemase genes

M:分子量标准；1：阳性对照； 2：阴性对照； 3—5：KP临床株

图2KPC-2基因扩增产物电泳图

Figure2Electrophoresis map of amplification products of KPC-2 gene

2.5 不同耐药基因阳性株与阴性株药敏结果比较blaKPC 基因、CTX-M-9及TEM基因阳性株与阴性株对氨曲南、氨苄西林/舒巴坦、厄他培南、头孢曲松、头孢他啶、头孢替坦、头孢吡肟、头孢唑林、亚胺培南的耐药率均无差异，均为 100%，3个基因阳性株和阴性菌对其他常用抗菌药物的耐药率均相近，见表4。

3 讨论

表4 CRKP不同耐药基因阳性株与阴性株对抗菌药物的药敏结果(%)

注：S为敏感，R为耐药

本研究收集的CRKP对阿米卡星、替加环素有一定的敏感性，但对替加环素的耐药率达50.88%，可能与近年来替加环素使用增加，耐药率随之增加有关[10]。Dong等[6]报道所检CRKP对阿米卡星和喹诺酮类药物的耐药率低。但本研究CRKP对左氧氟沙星的耐药率达97%，对阿米卡星的耐药率为57.89%，可能与Dong 等[6]研究收集的菌株来自儿童医院，儿童很少使用此类药物有关。

近年来，CRKP的耐药机制受到广泛的关注。目前研究结果显示，其主要耐药机制包括：(1)产碳青霉烯酶，包括以产KPC酶为主的A类碳青霉烯酶和以锌离子为活性中心的 B 类金属β-内酰胺酶和 D 类的OXA-48; (2)高产AmpC 酶或ESBLs合并外膜蛋白的丢失; (3)外排泵的高表达; (4)结合位点缺失、数量下降或亲和性降低等[13-16]。本研究共检测了包含碳青霉烯酶基因及ESBLs基因在内的14种耐药基因。

57株CRKP均检出ESBLs基因,仅1株检出NDM-1，未检出IMP及VIM。我国ESBLs流行的种类主要为CTX型和SHV型[17]，本研究收集的CRKP菌株中，SHV型占96.49%(55/57)，CTX型占71.93%(41/57)。

本研究检测出的碳青霉烯酶耐药基因主要为KPC基因，检出率为68.42%，KPC-2是导致该院CRKP对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。KPC酶于2004年在我国浙江省首次被发现[18]，随后全国多个地区相继有产KPC-2酶CRKP流行的报道[19-21]。有报道[22]指出，产KPC-2是中国华东地区肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的重要原因。不同国家CRKP携带的碳青霉烯酶耐药基因差异较大，我国肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的常见基因类型为KPC-2，少有NDM-1，偶有金属酶IMP、VIM、SIM及OXA-48检出；而印度以NDM为主，西班牙以VIM为主[22]。在我国不同地区，CRKP携带的碳青霉烯酶耐药基因分布也有一定差异，KPC-2是我国肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要基因类型，其中福建、河南、河北、蒙古KPC-2的检出率达100%，北京、广东、山东地区接近70%。有一项研究显示湖南地区的耐药基因主要为NDM-1(4/5,80%)，推测可能与该项研究中湖南地区检测菌株数量少相关[9]。

本研究存在不足之处，首先由于检测仪器为半自动微生物分析仪，药敏试验并未涵盖所有推荐的治疗药物，如多粘菌素、磷霉素以及新上市的头孢他啶/阿维巴坦[23]，以致药敏试验数据不充分，对临床治疗的参考价值受到一定的限制。另外，本研究只检测了部分有代表性的耐药基因，对于其他少见的基因如KPC-12、NDM-5并未进行检测，且未进行同源性分析，可以在后续研究中对CRKP的耐药及传播机制进行更加深入地研究。

总体而言，本研究对CRKP的临床分布、药敏试验及耐药基因进行了分析，但具体的传播机制及临床治疗方案需待进一步研究。面对CRKP感染的挑战，临床医务人员应加强医院感染防控意识，合理使用抗菌药物，控制CRKP播散流行。

致谢：诚挚地感谢中南大学湘雅三医院及长沙市第一医院微生物室的老师对本次研究工作提供的支持!