磷酸三(1，3-二氯二丙基)酯(TDCPP对斑马鱼胚胎急性毒性研究)

王玮彤，赵雪松

(吉林师范大学 环境科学与工程学院，吉林 四平 136000)

0 引言

阻燃剂被广泛应用在电子、电器、化工、交通、建材、纺织品、石油、采矿等领域，成为仅次于增塑剂的材料助剂[1]。以多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers， PBDEs)为代表的溴代阻燃剂因其性能优越及价格低廉，曾成为最重要的有机阻燃剂[2]，但由于其在环境中具有持久性、生物富集性和生态毒性，欧盟、美国、加拿大和中国等相继发布系列政策限制或禁止PBDEs的使用。而有机磷阻燃剂(Organophosphorus flame retardants， OPFRs)因能满足新型阻燃剂高效、低烟、低毒、多功能的要求，产量和使用量逐年增加，现成为当今阻燃剂研究的热点[3]。磷酸三(1，3-二氯二丙基)酯(TDCPP)是一种典型的有机磷阻燃剂，广泛应用于建材、纺织、化工以及电子等行业[4]。由于TDCPP属于添加剂，以非化学键方式添加到产品中，导致其易于扩散到周围环境中[5]，因此它虽作为溴代阻燃剂的替代品，但是也属于环境中广泛存在的新兴持久性有机污染物。环境监测的数据显示，目前全球室内和室外空气、地表和地下水、沉积物和生物群TDCPP的检测率极高。例如：美国加利福尼亚地区室内灰尘中TDCPP的浓度为2 100 g/g[6]；Green等研究发现挪威垃圾填埋场与机动车销毁处沉积物中OPFRs浓度较高，分别为746 000～1 790 000 g/kg与27 700～33 800 g/kg，其中TDCPP的浓度分别为250～8 800 g/kg与1 500～4 100 g/kg[7]；Chen等研究发现，挪威沿海地区黑背鸥和银鸥的鸟蛋中TDCPP浓度分别达到1.9 ng/g与0.17 ng/g[8]；我国厦门与青岛附近海域TDCPP的浓度范围为24.1～377 ng/L[9]；珠江中草鱼(Clariusfuscus)与鲶鱼(Cyprinusidellus)体内TDCPP的浓度均达到了251 ng/g(湿重)[10]。

斑马鱼(zebrafish， danio rerio)，又名蓝条鱼，体长约4～5 cm，体呈纺锤形，其体侧斑纹酷似斑马。近年来，斑马鱼作为一种非常好的实验模型，被越来越多的应用到毒性测试和独立研究中。美国环境保护署(USEPA ECOTOX Database，2000)和经济合作发展组织(OECD，1998)曾将斑马鱼列为研究内分泌干扰化学物质对脊椎动物影响的模式生物之一。本实验以斑马鱼胚胎作为受试生物，观察TDCPP暴露对水生生物急性发育毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

TDCPP，纯度>99.9%，购自Sigma公司。二甲基亚枫(DMSO)购自Sigma公司。储备液配置方法：取1 g/L TDCPP 1 mL和DMSO 9 mL混合均匀，即把1 g/L TDCPP溶液稀释为100 mg/L TDCPP储备液。稀释液为经过珊瑚砂、陶粒、活性炭和滤棉过滤灭菌超过24 h的自来水。用移液枪分别取50 μL，200 μL，800 μL和1.8 mL TDCPP储备液，各自用稀释液定容到1 L，即为浓度分别为5 μg/L， 20 μg/L， 80 μg/L和180 μg/L的暴露液。

1.2 斑马鱼的养殖与胚胎的收集

实验所用的斑马鱼购自中国科学院武汉水生生物研究所，健康状况良好。将斑马鱼雄雌分开放置在实验条件相同的鱼缸中，鱼缸所用水来自经过充分曝气且灭菌后的循环水箱。水温恒温28 ℃，pH值6.5～7，每日投喂三次新鲜的丰年虫卵。丰年虫卵孵化方法如下：取虫卵3 g和食用盐20 g加入到1 L水中，曝气孵化28 h，水温恒温28 ℃。亲代斑马鱼养殖30天后，可用于孵化胚胎。按照雌鱼与雄鱼1∶2选取健康活泼的成年斑马鱼进行交配。在鱼缸内铺放两层网，防止亲鱼误食鱼卵。前一天晚上将雌雄斑马鱼共同放置在黑暗环境下12 h，第二天光照追逐，光照1 h后在显微镜下挑选囊胚期的胚胎用于暴露实验。

1.3 暴露实验

实验共设置浓度为0， 5 μg/L， 20 μg/L，80 μg/L和180 μg/L的TDCPP暴露组，在5个直径为180 mm的结晶皿中分别放入200 mL不同浓度的暴露液以及600个健康的斑马鱼胚胎，暴露斑马鱼胚胎至受精后168 h(168 haf)。每隔一天更换染毒溶液，并挑选出杂物和死亡胚胎。

1.4 急性发育指标统计方法

在暴露期间，观察胚胎的形态发育，记录并统计胚胎24 haf，48 haf，72 haf，96 haf以及120 haf的存活率、48 haf和84 haf的心率、72 haf的孵化率和畸形率，以及168 haf的体长、体重，并绘制成柱形图进行比较分析。具体统计方法参照文献[11]。

2 结果与讨论

2.1 急性暴露TDCPP对斑马鱼胚胎存活率的影响

图1为急性暴露TDCPP对斑马鱼胚胎存活率的影响。

图1 急性暴露TDCPP对斑马鱼胚胎存活率的影响

由图1可知，与对照组相比，TDCPP的急性暴露引起了斑马鱼胚胎存活率的降低，高浓度暴露组尤为明显。在浓度为5 μg/L，20 μg/L与80 μg/L的TDCPP暴露液中，24～120 haf胚胎/幼鱼存活率分别从94%降低至80%，91%降低至78.4%，88%降低至78%，但是与对照组120 haf时的96%相比差异不太显著。在高浓度暴露组180 μg/L TDCPP中，24～120 haf胚胎/幼鱼存活率由73%显著降低至45%，并且在72～96 hpf，存活率降低幅度较大，说明幼鱼孵化出膜后，失去了绒毛膜的保护作用，直接暴露于高浓度的TDCPP导致其大量死亡。本实验结果说明TDCPP能够直接诱发胚胎死亡，且高浓度的TDCPP对胚胎死亡率的影响更大。Xu等研究也发现较大浓度的TDCPP会直接诱发斑马鱼胚胎死亡[12]。

2.2 急性暴露TDCPP对斑马鱼胚胎心率的影响

图2为48 haf和84 haf急性暴露TDCPP对斑马鱼胚胎心率的影响。

图2 急性暴露TDCPP对斑马鱼胚胎心率的影响

由图2可知，与对照组相比，TDCPP暴露组斑马鱼胚胎心率有所降低，但是差异不显著；而在84 haf，暴露浓度为180 μg/L时，TDCPP对斑马鱼胚胎心率的抑制作用较为明显，呈现出浓度依赖关系，心率从对照组的116次/min降低到70次/min，下降了39.66%。通过此图还可以看出，在斑马鱼胚胎/幼鱼从48 haf到84 haf的生长发育过程中，各个实验组在两个时间点上的心率差有所减弱，说明胚胎/幼鱼适应了外源物质的刺激。石亚楠等研究也表明心率可以作为研究斑马鱼胚胎毒性的一个重要指标[13]。

2.3 急性暴露TDCPP对斑马鱼胚胎孵化率的影响

图3为72 haf急性暴露TDCPP对斑马鱼胚胎孵化率的影响。

图3 急性暴露TDCPP对斑马鱼胚胎孵化率的影响

如图3所示，与对照组相比，72 haf TDCPP暴露组中斑马鱼胚胎的孵化率呈下降趋势，180 μg/L暴露组显著下降了19.56%，说明TDCPP能够抑制胚胎的孵化，并且呈浓度依赖关系。由此可知在卵裂前，TDCPP就可以通过生物膜渗透进去，对胚胎进行毒性作用，进而抑制胚胎的孵化出膜。高丹等研究表明有机磷阻燃剂浓度与斑马鱼胚胎的孵化率呈负相关关系[14]，与本研究结果一致。

2.4 急性暴露TDCPP对斑马鱼畸形率的影响

图4为72 haf急性暴露TDCPP对斑马鱼畸形率的影响。

图4 急性暴露TDCPP对斑马鱼畸形率的影响

由图4可知，20 μg/L，80 μg/L，180 μg/L暴露组72 haf幼鱼畸形率较对照组显著增加，分别由对照组的6.98%增加至15.23%，30.64%与37.3%。在5 μg/L暴露组中虽然幼鱼也出现了形态学的异常，但是与对照组没有显著差异。高浓度暴露组致畸的主要原因可能是因TDCPP的浓度超过了胚胎所能承受的范围，导致胚胎细胞凋亡，或者发生DNA损伤，影响与发育直接相关的功能基因和蛋白表达，最终诱发幼鱼畸形。图5为在急性暴露期间TDCPP导致的幼鱼形态学异常，包括尾部畸形、卵黄囊水肿和心包水肿。本研究结果说明TDCPP对斑马鱼胚胎具有明显的致畸效应。

(a)发育正常 (b)尾部畸形

(c)卵黄囊水肿 (d)心包水肿 图5 斑马鱼发育形态

2.5 急性暴露TDCPP对斑马鱼幼鱼体重、体长的影响

图6为168 haf急性暴露TDCPP对斑马鱼幼鱼体重、体长的影响。

图6 急性暴露TDCPP对斑马鱼幼鱼体重、体长的影响

由图6可知，在暴露实验进行7天后，幼鱼的体重没有显著的变化(图6a)，高浓度暴露组幼鱼体重仅从对照组的11.165 mg减少到10.632 mg，差异不显著，但是体长则受到显著抑制(图6b)，高浓度暴露组幼鱼的体长由对照组的2 624.35 μm显著降低至2 170.18 μm，表明急性暴露TDCPP能够显著抑制幼鱼的生长发育。

3 结论

实验证明，急性暴露TDCPP能够影响斑马鱼胚胎/幼鱼的发育，表现为存活率降低、畸形率增加、孵化率降低以及心率和体长受到显著的抑制，并且这种影响随着暴露液TDCPP浓度的增大而明显。