树突状细胞疫苗在急性髓系白血病免疫治疗中的研究进展

白海英,温 静,王 丹,张伟华

(1.山西医科大学，太原030000； 2.山西医科大学第一附属医院血液内科,太原 030000)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，其病因复杂，异质性大，预后及长期生存率较差[1-2]。随着新的化疗方案的应用，超过80%的初诊患者在强化诱导化疗后可获得完全缓解，但大部分患者会再次复发，尤其是老年患者[3-4]。因此，预防或降低缓解后复发对于AML的预后至关重要。主动免疫是当今治疗AML的热点。树突状细胞(dendritic cell，DC)因其特有的捕获抗原和呈递抗原的能力，在激活机体T细胞免疫系统后，可进一步减少或杀伤微小残留病灶[5-6]，从而减少复发，延长患者生存时间，有望成为治疗AML的最佳方法。现就DC疫苗在AML免疫治疗中的作用予以综述。

1 DC的生物特性

DC起源于造血干细胞,广泛分布于机体各组织和器官,根据其来源可分为髓系DC和淋巴系DC，在体内以髓系DC为主[7],而髓系DC需经分化才具备特有功能。首先，前体细胞分化为未成熟DC，处于该阶段的细胞具有极强的抗原摄取能力，主要是诱导免疫耐受，是人体正常情况下的主要存在形式；其次，在各种因素的影响下未成熟DC进一步分化为成熟DC，其摄取抗原的能力明显降低，激活T细胞的能力和呈递抗原的能力显著增强，能够诱导Fas淋巴细胞凋亡，从而参与免疫应答调控。

DC是引发细胞免疫和体液免疫的重要介导者[8]。DC是目前已知的人体内功能最强大且唯一能激活静息期T细胞的专职抗原呈递细胞，其能够直接激活体内CD4+辅助性T细胞(T helper cells，Th)和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)，同时可以使B细胞产生抗体。因此，T细胞免疫有望在清除微小残留病变中发挥重要作用[9]。当机体发生肿瘤时，免疫系统通过监视功能识别突变或异常表达的肿瘤相关抗原，由DC识别并将肿瘤抗原加工成与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)相结合的抗原肽，形成MHC-抗原肽复合物，作为T细胞活化的第一信号，同时与T细胞表面高表达的CD80、CD40等黏附分子相结合，进而提供T细胞活化的第二信号，激活T细胞，产生抗肿瘤的免疫应答反应[10-11]。

2 DC与AML免疫

AML难治、易复发的原因可能与白血病细胞抑制免疫系统的识别和激活有关，如抑制DC的分化成熟，诱导其凋亡、分泌抑制性细胞因子如白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、转化生长因子-β1等。白血病细胞还能使MHC、共刺激分子等表达减少，且机体不存在抗AML系统，因此特异性T细胞无法检测和识别抗蛋白酶3、细胞特异抗原等，从而使肿瘤细胞发生逃逸[12]。因此，针对机体免疫系统的治疗成为当前血液系统疾病治疗的新方向。在大部分AML患者中，程序性死亡受体配体1(programmed death receptor ligand 1,PD-L1)呈过表达，而PD-L1是免疫系统重要的负调节分子，其对T细胞的活化产生抑制性信号[13],下调蛋白质酪氨酸磷酸酶-2磷酸酶信号，导致肿瘤细胞逃逸[14]。成熟的DCs是PD-L1表达的负性调控因素，体外修饰DC可以降低PD-L1的表达，提高共刺激分子以及细胞因子的表达，从而显著增强T细胞的抗肿瘤免疫能力[15]。

3 AML患者中的DC及功能

在大部分初诊AML患者中，髓样树突状细胞(myeloid dendritic cell，mDC)和浆样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)减少，小部分升高或正常。DC起源于造血干细胞，与单核细胞共同由前体细胞分化而来，在正常情况下DC处于平衡状态，当机体微环境或基因发生突变时，DC也随之发生改变[16]。有研究发现，FMS样的酪氨酸激酶3基因内部串联重复序列(FMS-like tyrosine kinase 3 internal tandem duplication，FLT3-ITD)突变阳性的AML患者中，mDC和pDC的含量明显高于FLT3-ITD突变阴性者，且从FLT3-ITD阳性的AML患者中分离出来的mDC和pDC的FLT3-ITD突变同样为阳性[17]。另外有学者发现，完全缓解后的AML患者外周血中也存在前体DC，但白血病相关标志为阴性[18]。由此可见，在AML患者中白血病相关DC明显增多，正常DC减少。

在AML患者中，骨髓是不成熟DC捕捉AML抗原的主要部位，且捕捉能力受AML细胞本身因素和细胞因子的影响。AML细胞可以表达某些抑制基因，抑制细胞免疫的激活、促进调节性T细胞形成，从而使大量调节性T细胞聚集。同时，AML细胞能抑制正常细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4的表达，使机体T细胞免疫识别和杀伤功能异常或减低[19]。成熟DC在AML中具有呈递抗原和激活CTL反应的作用。体外培养获得的DC可以诱导出针对白血病相关抗原如Wilms瘤基因1(Wilms′tumor gene 1,WT1)蛋白的特异性CTL反应，而Bcr/abl肽转染或孵育的DC和FLT3-ITD阳性的DC产生的是针对受Bcr/abl和FLT3-ITD调节的抗原特异性CTL反应[20]。说明不同方式获得的DC有特定的免疫诱导作用。

4 DC在AML中的作用及来源

4.1DC诱导活化T细胞免疫机制 DC是唯一能激活静息状态下T细胞的细胞，并能够为T细胞活化提供所需的所有信号[21]。T细胞必须在3个活化信号的共同作用下才能达到最佳免疫效应[19]。第一信号是MHC分子与T细胞受体结合；第二信号是DC表达的CD80和CD86与T细胞表达的CD28受体相互作用，形成共刺激分子；第三信号则直接激活体内的CD4+Th细胞和CD8+CTL。Th细胞的免疫应答在免疫治疗中起重要作用，而IL-12是控制Th1极化的重要细胞因子，可由DC特异性释放。

4.2DC的来源

4.2.1白血病DC 临床上常用的白血病DC有两种：一种是自体白血病DC，另一种是异体白血病DC[19]。自体AML-DC是从白血病患者自身中获得，其保留了由自体起源的白血病细胞表达的整个白血病相关抗原谱。因此，AML-DC具有诱导针对广谱白血病相关抗原自体起源的白血病细胞的抗白血病免疫潜力，而无需抗原鉴定或外源性细胞抗原的加载[8]。虽然理论上这种方法可行，但实际上有诸多限制：①获取AML-DC疫苗的技术有一定的局限性，虽然近年来体外培养AML-DC的实验及方案较多，但仍需进一步成熟；②在AML-DC疫苗细胞培养过程中，无法确保正常成熟表型的正常表达，同时不能准确控制AML-DC的数量；③在体外培养过程中，无法完全模拟AML-DC需要的微环境，因此可能会出现DC功能紊乱的现象。尽管现实中有众多不可控因素，但未来AML-DC的发展仍有较大空间。

4.2.2正常DC 由单核细胞分化而来的DC(monocytes-derived dendritic cell，mo-DC)是目前临床肿瘤免疫治疗常用的DC类型[22]。在外周血循环中，单核细胞约占白细胞总数的10%，因此可以通过白细胞分离术和单核细胞分离术获得大量的mo-DC。在造血干细胞移植过程中，患者获得完全缓解后，可采用粒细胞集落刺激因子动员血细胞正常分化并进行采集mo-DC。同理，非AML-DC也可以用于临床。有研究发现，非AML-DC较AML-DC有明显优势，但非AML-DC需要进行抗原修饰，如加入外源肽、白血病细胞裂解物、干扰白血病细胞合成的信使RNA(messenger RNA，mRNA)编码基因等，进而发挥刺激T细胞活化、增强免疫识别、杀伤和破坏白血病细胞的作用[19]。

4.2.3外周血DC 外周血指标可直观反映机体的生理变化，因此外周血中的DC最有可能成为机体生理来源的DC的代表[23]。外周血DC可通过粒细胞集落刺激因子动员AML患者的外周血获得，但在功能上可能有明显欠缺[24]。因此，对于外周血DC疫苗的应用仍需进一步探讨。

5 AML的DC疫苗

5.1CD34+-DC CD34+-DC是最早应用于临床的同种异体DC疫苗。2001年Fujii等[25]首次在造血干细胞移植复发患者中尝试使用同种异体CD34+-DC,结果发现，患者有延迟超敏反应发生，证明同种异体CD34+-DC可诱发T细胞介导的免疫反应。为了进一步证实CD34+-DC的作用，Balan等[26]采集了正常人的脐带血，采用分离、体外培养等方法获得大量CD34+-DC,通过不同的修饰方法得到XCR1+-DC和XCR1-CD34+-DC，结果发现，XCR1+CD34+-DC有更加特异地刺激机体T细胞免疫的功能，同时能够调控众多表达DC的基因，选择性高表达抗细胞凋亡基因、抗病毒基因以及作用于自然杀伤细胞或T细胞的细胞因子/趋化因子,证明CD34+-DC能提高机体免疫力，有望进一步应用于临床。从造血干细胞或造血祖细胞中分离、提取的CD34+-DC[1]，通过优化其分化过程的mRNA序列加工、增强MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ呈递以及敲除分化过程中潜在抑制免疫基因等增强抗肿瘤免疫反应，有望成为当前预防异基因造血干细胞移植后复发的有效治疗方案。

5.3Th1-极化DC Th1-极化DC是在体外培养单核细胞DC的第3天，通过加入含有Toll样受体7/8激动剂R848、Toll样受体3配体poly(I：C)以及TNF-α、IL-1β、γ干扰素以及前列腺素E2等细胞因子的混合物，促使特异性DC分化得到的，与常规标准7 d获得的DC相比，Th1-极化DC对抗原的摄取、呈递以及刺激特异性T细胞的能力一致，但共刺激分子CD80和CD86的表达率更高[30]。DCs激活抗肿瘤免疫应答的能力高度依赖于其分泌炎症细胞因子的能力。IL-12p70在CD4+细胞极化为Th1细胞反应方向的应答中发挥关键作用[31]，而CD4+Th1细胞又可刺激或诱导具有特异性杀死肿瘤细胞功能的CD8+CTL活化，Toll样受体7/8激动剂复合物在诱导DC分化过程中明显刺激DC高表达IL-12p70[29]。此外，IL-12p70在自然杀伤细胞的活化过程中也具有重要作用，进而起到多环节加强机体抗肿瘤效应。在成功获取功能完整、性质稳定的DC后，通过电穿孔法对其进行不同抗原负载，如WT1、PRAME(优先表达黑素瘤中的抗原)等，进而得到具有不同功能及抗原特异性的新型疫苗，并已在小鼠模型中成功验证诱导T细胞免疫的作用是有效的[32]。Th1-极化DC已经入Ⅰ/Ⅱ期临床试验，但结果尚未公布。

5.4DCP-001 DCP-001[33]是一种新型的DC疫苗，该类疫苗不仅具有同种异体DC的相关免疫作用，而且还保留了AML相关抗原表达的能力。DCP-001的制备过程可控，性质稳定，临床上可安全制备。在米托蒽醌类药物的存在下，将细胞在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、TNF-α以及IL-4的混合物中培养以加速DC分化，然后加入前列腺素E2、TNF-α和IL-1β促进成熟，严格把握DC成熟后的质量控制，并根据其免疫表型以及对T细胞活化的刺激反应方向和能力等进行分类。该类疫苗作用可靠、疗效安全，已进行Ⅰ期临床试验。国外有研究对12例诱导缓解的老年AML患者分别在第0天、第14天、第28天以及第42天使用了DCP-001疫苗，在治疗开始前和治疗结束后监测机体免疫反应，结果发现，几乎所有患者的T细胞免疫和肿瘤免疫应答增强，患者的总体生存时间延长，其中1例在治疗后36个月仍存活，说明DCP-001疫苗有强大的抗白血病及免疫介导作用，可用于AML的治疗[31]。随着医学技术的发展，DC疫苗在AML的治疗中将会有新的突破。

6 问题与展望

随着人类对AML发病机制的不断认识以及医学的发展，寻求缓解AML更好的方法、延长患者生命不再是临床治疗的最终目标，而彻底治愈AML已成为当前治疗的终极目标。免疫治疗技术的成熟、DC疫苗免疫作用的明确以及化疗与DC免疫组合疗法的应用[34]给治愈AML提供了新方向。但目前疫苗的制备仍有一定困难，存在疫苗生产周期短、生产费用昂贵、数量少、无法稳定生产等问题。同时，DC疫苗尚处于临床试验阶段，选取的患者均为复发难治或传统方法无法挽救的患者，到目前为止暂无初诊患者使用DC治疗的报道，这对于DC疫苗的临床效果研究有一定的影响。对于DC疫苗仍需完善制备技术，探索新的功能，探讨AML的发病机制以及与DC间的相互作用，以期为更好地治疗AML奠定基础。