基于聚乙二醇非对称修饰金纳米粒子的铝离子比色检测方法

陈心悦 哈伟 师彦平

摘 要 制备了聚乙二醇和柠檬酸钠不对称修饰的大尺寸金纳米粒子（AuNPs）， 利用柠檬酸根与Al3+之间的螯合作用促使粒子发生定向团聚， 实现了比色法检测Al3+， 方法高效、准确、稳定。首先， 制备不同粒径的柠檬酸钠修饰AuNPs（13、26和38 nm）， 考察了粒子尺寸与比色法检测Al3+的灵敏度之间的关系， 结果表明， 增大粒径可显著提高检测灵敏度， 其中38 nm AuNPs裸眼检测Al3+的检出限可达1 μmol/L;随后， 将38 nm柠檬酸钠修饰AuNPs负载于载玻片上， 利用载玻片表面掩蔽AuNPs表面部分位点， 从而可在其余位点上不对称修饰惰性稳定基团聚乙二醇， 通过激光动态散射仪、透射/扫描电镜、能谱仪表征了粒子表面结构。在此比色传感体系中加入Al3+可实现AuNPs的定向和可控地聚集， 形成的寡聚体在溶液中稳定存在。此体系响应信号与Al3+在1 μmol/L～100 mmol/L内呈良好的线性关系， 线性方程为y=0.06485x + 0.60851， （R2=0.990）。此传感体系对Al3+具有良好的选择性， 常见金属离子不干扰检测， 可应用于饮用水样品中Al3+的检测。

关键词 金纳米粒子; 不对称修饰; 定向聚集; 铝离子; 比色检测

1 引 言

铝元素是地球上储量第三的元素， 是地壳中最丰富的金属元素[1]。适当摄入金属元素（钠、钾、镁、铝、锌、铁和铜）对于机体生理代谢过程具有重要意义， 摄入过量、不平衡或缺乏均会引起机体代谢的异常[2，3]。根据WHO的报告， 日常可摄入的铝元素为3～10 mg， 一周内机体可接受的最大量为7 mg/kg[4，5]。过量摄入铝元素则会蓄积细胞毒性， 引发多种疾病， 如阿尔茨海默氏症[6]、帕金森氏症疾病[7]和肌萎缩侧索硬化症[8]等。因此， Al3+的检测具有重要意义。目前， 检测Al3+的方法， 如高效液相色谱-耦合质谱法、电感耦合等离子体-质谱法、原子荧光光谱法、原子吸收法、电化学法、光化学法和荧光法等[9～12]， 依靠仪器检测存在仪器昂贵、操作复杂、耗时长、样品前处理过程繁琐等问题， 难以实现快速实时在线检测[13，14]。因此， 迫切需要发展简单、快速、低成本方法用于Al3+的检测。

金纳米粒子（AuNPs）摩尔吸光系数高， 具有表面增强拉曼散射和表面等离子体共振等光学性质[15～17]， 同时因其制备简单、易于功能化修饰及可视化比色检测的特性而受到广泛关注。目前， 已有文献报道基于柠檬酸钠修饰AuNPs的Al3+比色检测方法[18，19]， 其作用机理是根据路易斯酸碱理论， Al3+与柠檬酸根的供氧配体即羧酸根基团（COO）发生螯合作用， 形成稳定的复合物， 同时破坏了粒子表面的电荷平衡， 引发粒子团聚， 导致表面等离子共振发生位移， 从而产生肉眼可见的颜色变化及紫外可见吸收光谱的变化。Chen等[11]采用13 nm AuNPs检测饮用水中Al3+， 发现在pH 2.9的条件下， 可实现较低浓度Al3+的裸眼检测; Bothra等[13]利用吡哆醛衍生物功能化的AuNPs， 通过骨架中N及吡哆醛OH与Al3+发生络合作用， 实现了饮用水中Al3+的检测; Xue等[8]采用5-巯基四唑修饰的AuNPs， 利用Al3+与四唑的含氮配体发生配位作用检测Al3+。然而， 传统比色法检测通常采用小粒径AuNPs（10～20 nm）比色检测Al3+， 未修饰的裸AuNPs灵敏度相对较低; 此外， 在已有的基于AuNPs的Al3+比色检测体系中， 由于AuNPs易发生不规律、非定向的团聚方式， 形成大规模团聚体， 在溶液中不稳定且极易沉淀， 易受外界条件的干扰， 导致溶液颜色随时间发生变化， 影响了定量检测的准确性[20，21]。

已有文献证明， 只有当检测目标物的量多于AuNPs时， 才能实现比色检测， 而增大粒子尺寸， 可有效降低AuNPs摩尔数量， 实现低浓度目标物的检测[22]。然而， 增大AuNPs尺寸会严重影响其在溶液中的稳定性。针对这一问题， 可通过在AuNPs表面修饰水溶性良好的长链聚合物例如惰性稳定基团聚乙二醇（PEG）改善其穩定性。本研究制备了一种具有较大尺寸、聚乙二醇（PEG-SH）不对称修饰的AuNPs， 建立了比色检测Al3+的方法（图1）。利用载玻片为基底， 将大尺寸AuNPs固定在玻片上， 少数位点被玻片所掩蔽， 大多数位点暴露在外， 利用AuS键将PEG修饰在AuNPs未与玻片接触的表面， 这种不对称修饰的优点体现在：（1）水溶性优良的惰性PEG基团可有效稳定大尺寸的AuNPs， 使其在提高灵敏度的同时在水溶液中保持稳定; （2）PEG占据粒子表面大多数区域， 限定区域的作用位点与Al3+产生螯合作用， 以定向可控的方式团聚， 形成寡聚体稳定存在于溶液中， 有效拓宽检测的动态范围。本研究应用PEG非对称修饰的AuNPs， 实现了Al3+的高效、灵敏、稳定的检测， 裸眼检测低至1 μmol/L。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

JSM-6701F冷场发射型扫描电镜（日本电子株式会社）; Zetasizer Nano 3600激发光动态散射仪（英国马尔文仪器有限公司）; Lambda 35紫外-可见分光光度计（美国珀金埃尔默股份有限公司）; TF20透射电子显微镜（美国FEI公司）。

三水合氯金酸（HAuCl4·3H2O， Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇贸易有限公司）; 柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O， 北京化工工业集团有限责任公司）; 3-氨基丙基-三甲氧基硅烷（C9H23NO3Si， APTES， 阿拉丁生化科技股份有限公司， 中国上海）; 巯基聚乙二醇mPEG-SH（Mn=350， 上海炎怡生物科技有限公司）; Al（NO3）3、KCl、FeSO4·7H2O、CuCl2、Zn（NO3）2、NaCl、Pb（NO3）2、NiCl2、AgNO3等金属盐（天津市百世化工有限公司）; 实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

2.2 实验方法

2.2.1 AuNPs的制备 参考文献方法[23]合成粒径约为13、26和38 nm AuNPs， 方法简述如下：分别向100 mL 0.30 mmol/L的HAuCl4沸腾水溶液中加入3、2和0.75 mL 34.0 mmol/L的柠檬酸钠溶液， 沸腾条件下剧烈搅拌反应， 颜色变成橙红色、紫红色直至紫色， 继续保持沸腾15 min， 得到不同的纳米金胶体溶液。冷却至室温， 于4℃存储备用。利用激发光动态散射仪测定粒子尺寸， 采用紫外-可见分光光度计得到不同尺寸AuNPs的最大吸收峰， 分别为520 nm（13-nm AuNPs， 橙红色溶液）、 526 nm（26-nm AuNPs， 紫红色溶液）和533 nm（38-nm AuNPs， 紫色溶液）。

2.2.2 PEG不对称修饰AuNPs（PEG-AuNPs）的制备 参照文献[20，24]方法， 通过固态“Grafting to”策略将PEG-SH不对称修饰在AuNPs表面的特定区域。将载玻片（约1.5 cm×2.5 cm）浸润于Piranha溶液（H2O2-H2SO4， 7∶3， V/V）中， 在100℃下活化2 h; 浸润在含有150 μL APTES的乙醇溶液中， 70℃下孵育30 min。清洗载玻片， 将其浸润在柠檬酸盐稳定的AuNPs溶液中孵育1 h， 使AuNPs负载于玻片上， 清洗玻片后， 再次浸入1 mmol/L PEG-SH（pH 8.5， 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液）中， 孵育24 h， 取出玻片， 超声处理1 min， 即得到PEG不对称修饰的AuNPs（PEG-AuNPs）。所制备粒子的摩尔吸光系数为7.66 × 109 L/（mol·cm）[25]， 由朗伯比尔定律计算得到AuNPs溶液浓度为0.6 nmol/L。

2.2.3 PEG-AuNPs的尺寸优化 将一系列浓度的Al3+溶液（10 μL）添加到不同尺寸的PEG-AuNPs（90 μL）溶液中， 用裸眼和紫外可见分光光度计检测， 考察到粒径大小对比色检测效果的影响。

2.2.4 PEG-AuNPs比色法检测Al3+ 将一系列浓度的Al3+溶液（10 μL）加入38-nm PEG-AuNPs溶液中（90 μL）， 涡旋混匀30 s， Al3+的系列终浓度分别为0.001、0.01、0.1、1、10和100 mmol/L。用紫外-可见光谱、扫描电镜、透射电镜、能谱仪和裸眼观察对结果进行表征。

2.2.5 选择性实验 将一系列Al3+、K+、Fe2+、Cr3+、Na+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+和Ag+标准溶液（10 μL）分别加入38 nm PEG-AuNPs溶液中（90 μL）， 终浓度均为10 μmol/L， 涡旋混匀30 s后观察比色结果， 并利用紫外-可见分光光度计检测。

2.2.6 水样处理 取兰州市自来水样， 经0.22 μm滤膜过滤后， 采用本方法进行测定。

3 结果与讨论

3.1 PEG-AuNPs的制备

基于AuNPs比色法检测中， AuNPs的尺寸显著影响检测的灵敏度[26，27]。将制备的不同尺寸（13、26和38 nm）AuNPs分别与Al3+反应， 结果如图2和图3所示。当粒子尺寸从13 nm增大至38 nm时， 裸眼检测Al3+的最低浓度从100 μmol/L下降至1 μmol/L， 表明AuNPs粒子尺寸越大， 靈敏度越高。这是因为只有当目标物分子量多于AuNPs数量时， 才能实现比色检测， 在同等摩尔量的AuNPs检测体系中， 粒子尺寸越大， 摩尔数量越少， 则可比色检测的目标物浓度越低。然而， 在检测中发现， 大尺寸AuNPs虽能检测低浓度Al3+， 但易发生非定向的大规模团聚， 在溶液中迅速沉降， 导致溶液颜色消失。这种时间依赖性的颜色变化对反应条件（温度、pH、检测时间）要求较高， 实验的重复性差， 严重影响方法的准确性和稳定性。鉴于比色法检测灵敏度和稳定性相互矛盾的问题， 本研究选用38 nm大尺寸AuNPs以提高检测的灵敏度， 同时在AuNPs表面特定区域修饰大的惰性稳定基团PEG， 改变粒子团聚方式， 提高大尺寸AuNPs的稳定性。

首先， 在Piranha溶液中活化载玻片， 使其表面富含羟基; 其次， 通过硅烷化反应将APTES修饰到羟基化的载玻片表面， 使玻片表面带正电荷， 利用静电相互作用将表面带负电荷的柠檬酸根修饰的AuNPs固定在载玻片表面， 此时粒子表面大多数位点暴露在外， 少数位点被玻片所掩蔽。随后， 将玻片浸入到PEG-SH溶液中， 利用AuS键将PEG键合到AuNPs表面未与载玻片接触的位点， 得到PEG功能化的AuNPs。最后通过超声处理， 使PEG-AuNPs从载玻片上剥离， 其被玻片掩蔽的位点暴露出来， 可与Al3+产生螯合作用， 从而使粒子发生团聚。长链的惰性基团PEG占据了粒子表面大多数位点， 可使粒子定向团聚， 在溶液中保持稳定， 改变常规AuNPs非定向、不规则的团聚方式。

3.2 PEG-AuNPs的表征

对合成的PEG不对称修饰的38-nm AuNPs（PEG-AuNPs）进行表征。如图4所示， 在载玻片表面修饰AuNPs后， 载玻片表面颜色呈紫红色， 说明带负电荷的大尺寸AuNPs通过静电吸引力已成功固定在玻片上。利用激发光动态散射仪表征制得的PEG-AuNP粒径及Zeta电位， 发现未修饰PEG的AuNPs平均电位值为42.6 mV， 而不对称修饰PEG后， 电位值为22.3 mV， 这一明显的位移说明粒子表面多数位点已被PEG占据， 而之前与玻片所接触的区域依然呈现负电性， 可用于检测Al3+。如图5所示， 在吸收光谱图中，柠檬酸根稳定的AuNPs在533 nm处出现了一个典型的等离子体共振峰， 修饰PEG后， PEG-AuNPs等离子体共振吸收峰红移到540 nm， 说明粒子表面致密的PEG单分子层显著改善了局部折射率[28，29]。AuNPs的粒径、形状及结构修饰直接影响了局域表面等离子体共振（LSPR）的散射半径， 且LSPR的位移与附着在粒子表面的分子质量成正比[29，30]。利用透射电镜进一步考察了修饰前后粒子形貌的变化（图6插图）， 发现PEG-AuNPs表面大部分区域有明显的修饰层， 厚度为1～2 nm; 同时能谱表征结果也显示， 修饰PEG后， 在粒子表面发现S元素， 这是由于AuS键的存在。上述表征结果均证实了PEG对AuNPs成功的非对称修饰。这种利用玻片的固态修饰方法限定了粒子发生团聚的区域， 可改变传统粒子大规模的团聚方式， 使寡聚体稳定存在于溶液中， 使基于纳米粒子的比色检测方法更稳定， 拓宽了线性检测范围。

3.3 基于PEG-AuNPs比色檢测Al3+的灵敏度

将一系列浓度梯度的Al3+加入到PEG-AuNPs溶液中， 如图7所示， 当Al3+浓度从1 μmol/L增加到100 mmol/L时， 溶液颜色从紫色变为灰色， 发生了明显的颜色梯度变化。在吸收光谱中， 分散的PEG-AuNPs在540 nm处具有特征峰， 加入Al3+后， 因定向聚集在730 nm处产生新的吸收峰， 随着目标物浓度的增大， 540 nm处吸收峰强度渐减弱， 730 nm处吸收峰强度逐渐增强。这是由于PEG-AuNPs形成的寡聚体数目增多， 利用扫描电镜可以明显观察到粒子以二聚体或三聚体的方式定向团聚（图7B， 红圈部分）[31]。同时， 吸收光谱结果显示吸光度比值A/A0（A730/A540）与Al3+浓度在1 μmol/L～100 mmol/L范围内呈线性关系， 检出限（LOD， 3σ/S）为0.93 μmol/L（LOD=3σ/S）， 比传统的未修饰功能化基团的13 nm AuNPs检出限低两个数量级， 极大提高了检测灵敏度。作为对比， 在同等实验条件下考察未修饰PEG的大尺寸AuNPs检测Al3+时的灵敏度及其团聚方式。如图3所示， 由于均采用大尺寸AuNPs， 二者的检出限均约为1 μmol/L， 进一步证实了粒子尺寸对于比色检测的灵敏度起着至关重要的作用。但常规AuNPs传感器易发生非定向团聚， 形成大规模聚集体而发生沉降， 当目标物浓度高于100 mmol/L时， A730吸收值不再增加反而下降， 导致了颜色的快速变化及光谱吸收峰的减弱[32]。因此， PEG不对称修饰的策略可提高AuNPs检测灵敏度， 并提高粒子的稳定性。

3.4 基于PEG-AuNPs比色检测Al3+的稳定性

通过比较PEG-AuNPs与常规的柠檬酸根稳定的AuNPs检测Al3+吸收值随时间的变化， 进一步探讨了检测Al3+的稳定性。用两种传感器检测1 mmol/L Al3+标准溶液， 在相同实验条件下监测730 nm处二者吸收值的变化， 结果如图8所示。常规的AuNPs溶液中， 由于大规模团聚体的形成， 730 nm处吸收值在1 min内迅速上升至最大值， 随后由于团聚体的沉降， 溶液颜色逐渐变浅， 30 min后即变为透明无色（图8A和8B）。而PEG-AuNPs在5 min内团聚达到平衡状态， 730 nm处吸收值达到最大值， 随后形成的寡聚体可稳定存在于溶液中， 颜色变化在4 h内保持不变， 说明PEG定向修饰后可改变基于聚集变色的比色传感体系的团聚方式（图8C和8D）。两种AuNPs显著的差异证实了定向团聚的聚集方式可有效提高比色传感器的长期稳定性。

3.5 方法的选择性

选择9种饮用水中常见的金属离子考察PEG-AuNPs体系对Al3+的选择性， 各金属离子终浓度均为10 μmol/L。 如图9所示， PEG-AuNPs对Al3+的选择性最佳， 对Fe2+、Zn2+及Ag+也具有一定的响应， 响应值远小于对Al3+的响应值。这是因为与其它离子相比， Al3+具有更高的有效电荷和更小的离子半径， 因此更易于与PEG-A面羧酸根基团发生螯合作用[9]。

3.6 实际样品分析

将PEG-AuNPs用于实际自来水样品分析， 水样中未检出Al3+。以空白自来水为基质， 配制了Al3+系列浓度的样品， 采用本方法进行检测。如图10所示， 吸光度比值A/A0（A730/A540）与Al3+浓度的线性方程为A/A0=0.12lg（C（μmol/L）） + 0.54（R2=0.990）， 检出限为0.62 μmol/L（3σ/S）， 加标回收率为97.8%～108.0%， 相对标准偏差为2.9%～9.9%。WHO规定的饮用水中Al3+限量水平为7.40 μmol/L， 因此本方法可用于饮用水中Al3+的检测[11，13，33]。 与文献报道的利用纳米粒子比色探针检测Al3+的方法相比（表1）， 本方法的线性范围较宽， 检出限较低。

4 结 论

构建了一种PEG不对称修饰的大尺寸AuNPs比色传感器， 此固态制备方法以玻片为载体， 利用玻片的掩蔽功能， 实现基团的不对称修饰。此功能化传感器相比于传统的小粒径AuNPs传感器， 有以下优势：大尺寸的AuNPs能显著提高检测灵敏度， 裸眼检测限比传统小尺寸AuNPs低2个数量级; PEG占据了粒子表面大部分位点， 因此使AuNPs表面有限的位点与Al3+产生螯合作用， 粒子定向可控的聚集方式， 不仅显著拓宽了检测动态范围， 而且改善了团聚体长期稳定性， 溶液颜色维持时间较长。这种新型PEG非对称修饰的方法改变了传统AuNPs功能化的方法， 为提高比色检测方法的分析性能开辟了新途径。

References

1 Walton J R. Encyclopedia of Environmental Health， 2011： 331-342

2 Hegde M L， Shanmugavelu P， Vengamma B， Rao T S， Menon R B， Rao R V， Rao K S. J. Trace Elem. Med. Biol.， 2005， 18（2）： 163-171

3 Mertz W. Science， 1981， 213（4514）： 1332-1338

4 Chen Y C， Lee I L， Sung Y M， Wu S P. Talanta， 2013， 117： 70-74

5 Krejpcio Z， Wójciak R W. Pol. J. Environ. Stud.， 2002， 11（3）： 251-254

6 Kong D， Yan F， Luo Y， Ye Q， Zhou S， Chen L. Anal. Chim. Acta， 2017， 953： 63-70

7 Liu Y W， Chen C H， Wu A T. Analyst， 2013， 35（9）： 2527-2530

8 Xue D， Wang H， Zhang Y. Talanta， 2014， 119： 306-311

9 Hu X， Mao X， Zhang X， Huang Y. Sens. Actuators B， 2017， 247： 312-318

10 Yang N， Gao Y， Zhang Y， Shen Z， Wu A. Talanta， 2014， 122： 272-277

11 Chen S， Fang Y M， Xiao Q， Li J， Li S B， Chen H J， Sun J J， Yang H H. Analyst， 2012， 137（9）： 2021-2023

12 Joshi P， Painuli R， Kumar D. ACS Sustainable Chem. Eng.， 2017，  5（6）： 4552-4562

13 Botha S， Kumar R， Sahoo S K. RSC Adv.， 2015， 5（118）： 97690-97695

14 Zhang M， Liu Y Q， Ye B C. Chem. Eur. J.， 2012， 18（9）： 2507-2513

15 Xin J， Zhang F， Gao Y， Feng Y， Chen S， Wu A. Talanta， 2012， 101： 122-127

16 Willets K A. Anal. Bioanal. Chem.， 2009， 394（1）： 85-94

17 Huang H， Liu X， Hu T， Chu P K. Biosens. Bioelectron.， 2010， 25（9）： 2078-2083

18 Mehta V N， Singhal R K， Kailasa S K. RSC Adv.， 2015， 5（42）： 33468-33477

19 Chen W， Jia Y， Feng Y， Zheng W， Wang Z， Jiang X. RSC Adv.， 2015， 5（76）： 62260-62264

20 Guo L， Xu Y， Ferhan A R， Chen G， Kim D H. J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（33）： 12338-12345

21 Thanh NT， Rosenzweig Z. Anal. Chem.， 2002， 74（7）： 1624-1628

22 Opperwall S R， Divakaran A， Porter E G， Christians J A， Denhartigh A J， Benson D E. ACS Nano， 2012， 6（9）： 8078-8086

23 Ma Y， Jiang L， Mei Y， Song R， Tian D， Huang H. Analyst， 2013， 138（18）： 5338-5343

24 Bayazit M K， Yue J， Cao E， Gavriilidis A， Tang J. ACS Sustainable Chem. Eng.， 2016， 4（12）： 6435-6442

25 Jain P K， Lee K S， El-Sayed I H， El-Sayed M A. J. Phys. Chem. B， 2006， 110（14）： 7238-7248

26 Liu X， Atwater M， Wang J， Huo Q. Colloids Surf. B， 2007，  58（1）： 3-7

27 B. Devika Chithrani， Arezou A. Ghazani， Warren C. W. Chan. Nano Lett.， 2006， 6（4）： 662-668

28 Guo L， Kim D H. Biosens. Bioelectron.， 2012， 31（1）： 567-570

29 Guo L， Ferhan AR， Lee K， Kim DH. Anal. Chem.， 2011， 83（7）： 2605-2612

30 Guo L， Chen G， Kim D H. Anal. Chem.， 2010， 82（12）： 5147-5153

31 Chen X Y， Ha W， Shi Y P. Talanta， 2019， 194： 475-484

32 Chen X Y， Ma R T， Ha W， Shi Y P. Sens. Actuators B， 2018， 274： 668-675

33 Guidelines for Drinking Water Quality. World Health Organization. 2011