健脾理气方对功能性消化不良大鼠十二指肠MLCK和PGE2-cAMP通路的影响

赵鲁卿 常雄飞 张声生*

(1.首都医科大学附属北京中医医院消化中心，北京 100010；2.北京中医医院顺义医院脾胃病科，北京 101300)

功能性消化不良(functional dyspepsia， FD)是临床最常见的消化系统疾病，且发病率呈逐年上升的趋势，但病情反复迁延，耗费大量的医疗资源[1]。传统观点认为，消化不良症状主要由胃产生，近年来越来越多的研究[2-3]表明，十二指肠黏膜屏障受损在FD发生的病理生理过程中起着非常重要的作用，而紧密连接是十二指肠机械屏障的重要组成部分，对于黏膜屏障功能的发挥至关重要。目前本病的病因及发病机制尚未完全阐明，临床西医没有特效药物，多以临时缓解症状为主，中医药通过整体调节和辨证论治，对于本病具有良好疗效。FD属中医“痞满”、“胃脘痛”范畴，本病病位在胃，主要涉及肝、脾二脏。“肝脾相关”理论在本病机制中尤为重要，肝为发病的重要因素，脾则为发病的关键环节，肝郁则气滞，脾损多脾虚，“脾虚气滞”是 FD的主要病理机制，本科结合多年临床经验创制中药健脾理气方，前期通过大规模随机对照研究[4]显示，该方可明显改善 FD 患者的消化道症状。并且，本研究前期动物实验结果表明健脾理气方可以修复FD 大鼠十二指肠紧密连接蛋白表达，但该作用涉及的信号通路尚不清楚。

研究[5-6]显示，肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase， MLCK)和前列腺素E2 (prostaglandin E2，PGE2)及其受体1(EP1)和4(EP4)介导的环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate， cAMP)/激酶A(protein kinase A，PKA)通路是影响紧密连接蛋白结构和功能的重要因素。本研究拟从以上两通路着手探讨健脾理气方可能的作用机制，以期发现新的治疗靶点，从分子生物学水平为中医药的推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物

由首都医科大学附属北京中医医院草药房提供(所有药材均从北京杏林药业公司购入)，制备水煎剂，简要过程如下：按健脾理气方组成(党参、茯苓、炒白术、姜厚朴、砂仁、元胡等)称取药物，每付共计91 g，加入蒸馏水1 500 mL，浸泡30 min，大火将水煮沸，煎煮约30 min，将药汁倒出盛入容器中，再次加入1 500 mL蒸馏水，煎煮第二遍，将两次的药液合并混匀，浓缩至95 mL，计算其生药含量为0.96 g/mL。

1.2 实验动物

由北京维通利华实验动物有限公司购入SPF级雄性SD大鼠(200±20)g 18只，饲养于中国中医科学研究院基础所屏障级实验动物室，实验动物许可证号：SYXK(京)2016-0021。所有动物都在恒湿(65%～70%)、恒温(22±1) ℃环境下饲养，每日光照12 h，所有动物均可自由饮食饮水。适应性饲养3 d后开始进行造模。

1.3 试剂及仪器

CFX 96 PCR仪(Bio-Rad公司，美国)，GoScript Reverse Transcription System( Promega公司，美国) 、GoTaq Qpcr Master Mix( Promega公司，美国)、Trizol Reagent(Cat15596-026)、cAMP Elisa试剂盒(BlueGene公司，中国)、PGE2 Elisa试剂盒(E02P0012，BlueGene公司，中国)、酶标仪(EON，BioTek instruments公司，美国)等。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组

将18只SD雄性大鼠采用数字表法按照1∶2比例随机分为正常组6只、造模组12只。造模完成后，将造模组大鼠随机分为模型组及健脾理气方治疗组，每组6只。

1.4.2 造模方法

采用目前国内公认的FD造模方法，即夹尾造模方法，具体操作如下：将造模组大鼠5只一笼分笼，用长柄海绵钳夹紧大鼠尾巴远端1/3处，使其暴躁恼怒，并且与同笼大鼠厮打，使整笼大鼠始终处于应激状态。每次刺激持续30 min，每3 h刺激1次，每日刺激4次，连续刺激1周。造模期间，如果发现大鼠尾巴有破损，需要用碘酊对破损部位进行消毒，防止感染。

1.4.3 灌胃给药

参照《现代医学实验动物学》[7]中动物给药剂量规范，换算出大鼠给药剂量为9.6 g·kg-1·d-1，即每100 g体质量大鼠，给药量为1 mL。造模完成后，给予正常组及FD模型组大鼠0.9%(质量分数)氯化钠注射液灌胃，每100 g体质量大鼠灌胃1 mL，而治疗组大鼠给予健脾理气方水煎剂灌胃，每100 g体质量大鼠灌胃1 mL。每日早晨8点准时灌胃，每日给药1次，连续给药7 d。

1.4.4 取材

实验前24 h，将各组大鼠均禁食(不禁水)。实验当天，将各组大鼠腹腔注射2%(质量分数)戊巴比妥钠麻醉，后逐层剪开皮肤、肌肉，暴露十二指肠，剪取大鼠幽门下0.5 cm后约3 cm的十二指肠组织，按实验方法的不同对新鲜组织进行处理：①置于 4%(质量分数)多聚甲醛中固定；②完全浸泡在RNA保护液中，保存于-80 ℃中备用；③放入冻存管，置于液氮中，后转移至-80 ℃冰箱保存，用于ELISA检测。

1.5 检测方法

1.5.1 HE染色

剪取大鼠十二指肠组织，置于4%(质量分数)多聚甲醛中固定，脱水、包埋、切片，厚度 8 μm; 用二甲苯溶液脱蜡，依次进行苏木精及伊红染色液染色，经二甲苯透明后使用中性树胶封片。

1.5.2 qPCR

取大鼠十二指肠组织，Trizol 法提取组织总RNA，按照 GoScript Reverse Transcription System 试剂盒说明书将 RNA 反转录为 cDNA，随后按照 GoTaq Qpcr Master Mix 试剂盒说明书进行 qPCR 反应: 95 ℃预变性2 min，随后进行40 个循 环: 95 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 退火/延伸 60 s。采用 2-ΔΔCt进行 RNA 相对表达量分析。MLCK 上游引物: 5′-GACGTGTTCACCCTGGTTCT-3′，下游引物5′-TTTGTGCAGCATCAGTGACA-3′；EP1上游引物：5′-ACTTGGTGTTTCATTAGCCTT-3′，下游引物：5′-GGCCGCTGCAGGGAGTTAGAG-3′，EP4上游引物: 5′-TCTCTGGTGGTGCTCATCTG-3′，下 游 引 物: 5′-ATTCTGATGGCCTGCAAATC-3′。

1.5.3 ELISA法

将十二指肠组织从-80 ℃冰箱中迅速取出，剪刀迅速剪碎，加入500 μL预冷PBS溶液，置于自动匀浆机中进行组织研磨匀浆；使用低温离心机，4 ℃，10 000g离心10 min，取上清液为待测样品；将适量待测样品用于BCA蛋白定量，得出待测样品蛋白浓度( μg/μL)。根据ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 三组大鼠十二指肠形态学比较

HE染色显示，治疗结束时3组大鼠十二指肠上皮黏膜结构完整，细胞排列整齐，无明显炎性反应表现，详见图1。

图1 三组大鼠十二指肠组织形态Fig.1 Morphology of duodenum(HE staining，100×)A：normal group; B:model group; C:JPLQ group; JPLQ:Jianpi Liqi.

2.2 三组大鼠十二指肠MLCK mRNA表达水平

模型组大鼠十二指肠MLCK的mRNA含量较正常组明显升高(P<0.01)，而健脾理气方治疗后，其mRNA含量明显下降(P<0.01)，详见表1。

表1 大鼠十二指肠MLCK mRNA表达量Tab.1 mRNA expression of MLCK in the duodenum

F=15.943，P=0.000；**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group;MLCK:myosin light chain kinase;JPLQ:Jianpi Liqi.

2.3 三组大鼠十二指肠PGE2含量

与正常组相比，模型组大鼠十二指肠的PGE2含量明显下降(P<0.01)，而经过健脾理气治疗后，其PEG2含量得到明显升高(P<0.01)，详见表2。

表2 大鼠十二指肠PGE2含量Tab.2 Concentration of PGE2 in the duodenum

F=28.031，P=0.000；**P<0.01vsnormal group ;##P<0.01vsmodel group;PGE2:prostaglandin E2;JPLQ:Jianpi Liqi.

2.4 三组大鼠十二指肠EP1和EP4 mRNA表达

PGE2受体有EP1-EP4四种亚型，其在消化道中均有表达，而PGE2主要通过EP1与EP4受体对肠道紧密连接蛋白的表达起到调控作用。研究结果显示，EP1 mRNA的表达在3组中差异无统计学意义，而EP4 mRNA模型组的表达量明显下降(P<0.05)，治疗组明显升高，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

表3 大鼠十二指肠EP1/EP4 mRNA相对表达量Tab.3 mRNA expression of EP1 and EP4 in the duodenum

*P<0.05vsnormal group ;#P<0.05vsmodel group;JPLQ:Jianpi Liqi.

2.5 三组大鼠十二指肠cAMP含量

模型组大鼠十二指肠cAMP含量相较于正常组显著降低(P<0.01)，而治疗组大鼠cAMP含量显著升高(P<0.01)，详见表4。

表4 大鼠十二指肠cAMP含量Tab.4 Concentration of cAMP in the duodenum

F=45.593，P=0.000；**P<0.01vsnormal group ;##P<0.01vsmodel group;cAMP：cyclic adenosine monophosphate；JPLQ:Jianpi Liqi.

3 讨论

FD由于发病机制并不明确，目前没有特效药物。中医认为脾与胃相表里， 五行属土，主受纳运化水谷。肝在五行属木，主疏泄， 条畅全身之气机。“食气入胃， 全赖肝木之气疏泄之， 而水谷乃化”， “脾土赖肝木之疏达之性，肝木亦靠脾土灌溉而升。”思虑太过则肝气郁滞， 疏泄不及则脾胃升降之气也因之而壅阻，雍滞日久则脾气虚损，功能失司，而见诸症。因此脾虚气滞是本病的核心病理环节，治法以健脾和胃，理气止痛为主。健脾理气方由党参、茯苓、炒白术、姜厚朴、砂仁、元胡等组成，诸药配伍补消兼施，升降有制，既能健运脾胃又可调理气机，虚可补，滞可行，共奏健脾和胃、理气止痛之效，该方临床疗效确切，但是作用机制并不明确。近年来，十二指肠黏膜屏障受损等关于FD的新的发病机制被提出，“脾为之卫”，脾虚则卫外功能失司，就消化道而言与现代肠道黏膜屏障功能理论相吻合。十二指肠是否是中医药作用的靶点，目前研究较少。

研究[2]表明，FD 患者十二指肠跨上皮电阻抗较低，细胞旁通透性增加，提示十二指肠黏膜完整性受损。紧密连接是十二指肠黏膜上皮细胞之间的主要连接方式，对上皮细胞屏障功能的正常发挥起着重要作用[4]。紧密连接蛋白的结构和功能受多条通路调节。MLCK属于钙调蛋白依赖的蛋白激酶家族，在钙和钙调蛋白存在下，MLCK对肌球蛋白轻链进行磷酸化作用，并促进肌球蛋白与肌动蛋白之间相互作用，促进肌动蛋白收缩，进而破坏细胞间紧密连接，引起细胞通透性升高[5，8]。该研究结果显示，健脾理气方可以降低FD大鼠十二指肠MLCK mRNA表达量。PGE2具有保护肠道紧密连接屏障的作用[9]，既往的基础研究[10-11]显示，PGE2对十二指肠紧密连接蛋白表达的调控，主要通过与EP1及EP4结合起作用。PGE2与其受体结合后，细胞内cAMP含量升高，PKA则由cAMP激活，对紧密连接蛋白装配以及上皮细胞旁通路的开放具有调节作用[12]。结果显示，健脾理气方可以提高FD大鼠十二指肠PGE2和cAMP的表达，提高EP4的mRNA表达量。前期相关药理研究[13-14]结果显示，健脾理气方中药物有效成分白术多糖可以修复肠道黏膜屏障[13]，甘草总黄酮可以促进PGE2分泌[14]。

综上所述，健脾理气方抑制MLCK，激活PGE2-EP4-cAMP/PKA信号通路，进一步改善FD模型大鼠十二指肠紧密连接蛋白结构和功能，恢复十二指肠黏膜屏障功能，可能是其治疗FD 的作用机制之一。