远志汤对慢性脑低灌注大鼠认知功能及海马凋亡蛋白的影响

刘 妍 陈玉静 陈文强 黄小波

(首都医科大学宣武医院中医科，北京 100053)

近年来研究[1-3]显示在痴呆常见的类型中，不论是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 还是血管性痴呆 (vascular dementia, VD) 患者，在影像学方面都表现出脑组织的低灌注[1]。慢性脑低灌注在老年人中普遍存在，当慢性脑低灌注发生后脑组织出现氧和葡萄糖供应不足，进而出现一系列的稳态改变，包括氧化应激、凋亡、自噬等，导致与认知功能相关的区域发生神经细胞死亡，并逐渐表现出认知功能的障碍，而海马区神经元凋亡与认知功能的障碍有着尤为密切的关系[2]。本课题组前期研究[3]显示具有安神益智、开窍醒神功效的对药远志和石菖蒲，能够改善糖尿病认知障碍大鼠的学习记忆能力，保护海马神经元。因此本研究选用由远志和石菖蒲组成的远志汤对慢性脑低灌注大鼠进行干预，研究远志汤是否通过调控海马凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2 相关 X 蛋白抗体(Bcl-2 associated X protein, Bax)及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3)，而起到保护海马神经元，改善慢性脑低灌注大鼠学习记忆能力的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级雄性SD大鼠，42只，鼠龄3个月，体质量250～280 g，由北京维通利华实验动物技术公司提供，实验动物合格证号：SCXK(京) 2016-0006，分笼饲养，维持室内温度18～25 ℃，湿度60%～70%，普通饲料喂养，自由摄食饮水，维持光暗12 h/12 h。

1.2 药物及主要试剂

参照本课题组前期研究[3]结果，远志汤中远志、石菖蒲按照1∶1的比例配伍。参照《中华人民共和国药典》(2015年版)[4]，确定生药产地、炮制方法，委托首都医科大学宣武医院制剂室进行加工，并对相对密度、pH值、卫生学等进行检测。4 ℃储存备用，保存时间不超过1周，用前摇匀。盐酸多奈哌齐由中国卫材药业有限公司提供。羊抗鼠抗体IgG H&L (Alexa Fluor®488)及羊抗兔抗体IgG H&L (Alexa Fluor®594)购自英国Abcam公司。免疫荧光相关试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 慢性脑低灌注模型的制备

参考相关文献[5]采用双侧颈总动脉结扎术制备慢性脑低灌注模型。大鼠术前适应环境1周，术前12 h禁食，4 h禁水。0.4%(质量分数)的戊巴比妥钠(0.5 mL/100 g i.p.)麻醉，仰卧位固定于手术台上，颈前皮肤去毛，碘伏消毒，颈前正中切开，钝性分离皮下浅筋膜，沿气管双侧仔细分离胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌，见动脉鞘；用玻璃分针分离暴露双侧颈总动脉并埋线，用丝线分别双重结扎两侧颈总动脉，并于两结扎点之间剪断血管，逐层缝合切口，消毒待醒。术中白炽灯照射保持大鼠肛温在36.5～37.5 ℃。术后单笼放置，防止窒息。

1.4 实验动物分组及给药

采用数字表法将大鼠随机分为：①对照组：3月龄正常大鼠；②模型组：慢性脑低灌注模型；③假手术组：分离暴露双侧颈总动脉，但不予结扎，不阻断血流；④远志汤高剂量组；⑤远志汤中剂量组；⑥远志汤低剂量组；⑦阳性药物对照组(盐酸多奈哌齐)。每组6只大鼠，其中，用药各组分别于造模术后1周开始灌胃给药，按 10 mL/kg灌胃，1次/d，给药4周；对照组、模型组及假手术组同时给予同等剂量0.9%(质量分数)的氯化钠注射液。

根据实验动物与人体的每千克体质量剂量折算系数表，成人与大鼠的折算系数为6.25，计算大鼠灌胃中药的剂量，远志汤高、中、低3 个剂量组，给药剂量分别为20、10、5 g/(kg·d)，以恒温水浴锅分别浓缩成含生药2.0、1.0、0.5 g/mL；盐酸多奈哌齐0.52 mg/(kg·d)制成溶液。

1.5 Morris水迷宫测试

给药结束后进行Morris 水迷宫行为测试。水迷宫由圆形水池和自动摄像及电脑分析系统组成。水池上方的摄像机同步记录大鼠的运动轨迹。测试前将水注入池中，水深30 cm，水面高出站台表面1 cm，放入奶粉使之成为乳白色，使大鼠不能见到站台，水温控制在22～25 ℃。实验前1 d，将每只大鼠头部染黑，每只动物第1天训练2次使之学习并产生记忆，入池位置为站台的对象限及邻象限，于象限边1/2弧度处将动物头朝池壁入水，120 s未找到站台者，将其引至站台，放置30 s引导其学习与记忆，训练期环境保持安静与参照物不变。

定位航行实验共进行5 d。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。实验结束后记录各动物的到达站台的游动时间及距离、初始角度、搜索站台的轨迹及逃避潜伏期，设定逃避潜伏期的时限为120 s。

定位航行实验结束后将水下平台撤除，在同一入水点将大鼠头朝池壁放入水中，让大鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台进行空间探索实验 ，记录大鼠在原平台象限的活动时间。

1.6 脑组织取材及切片制作

各组大鼠在术后5周麻醉处死，0.4%(质量分数)戊巴比妥钠(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后，沿肋弓剪开腹部皮肤、肌肉、腹膜，剪断肋骨，剪开膈肌，小心勿刺中心脏，剪至第二肋骨，轻轻分离心脏与胸壁，用止血钳翻开肋骨固定，再用镊子分离心脏前筋膜，暴露主动脉弓；磨钝针头从心尖部刺入心脏后，进入主动脉后夹上止血钳。灌注0.9%(质量分数)的氯化钠注射液并同时剪开右心耳，灌注氯化钠注射液约15 min，灌注量达200 mL，见右心耳流水变清亮、肝脏变苍白色，随后灌注4 ℃ 4%(质量分数)多聚甲醛(pH值为7.4)，400 mL，灌注时间30 min后，鼠前后肢、尾、颈僵硬，停止灌注。快速断头取脑，沿枕骨下剪断鼠头部，然后剪开头皮、尽量分离，用剪刀剪开鼠枕骨，再用止血钳撬开头骨，完全暴露脑组织，用止血钳插入颅底分离出脑组织，取出大脑置于4%(质量分数)多聚甲醛中后固定过夜，再于30%(质量分数)蔗糖中沉淀。24 h取出脑组织，参照大鼠图谱，选取海马、纹状体、大脑皮质和脑干等部位，滴取OCT冷冻切片包埋剂，固化后的组织从视交叉向后于恒低温切片机-18 ℃连续冠状切片，厚度8 μm，用赖氨酸处理好的玻片贴片，每张玻片贴3张切片。待贴好切片的玻片干燥后放于切片盒中，-20 ℃冰箱保存。

1.7 免疫荧光染色

切片在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化。微波照射进行抗原修复后，50%(体积分数)乙醇[含3%(体积量分数)H2O2]抑制非特异性过氧化物酶，99%(体积分数)蚁酸处理5 min，20%(体积分数)马血清常温封闭40 min，分别加入适量稀释的一抗，Bcl-2、Bax和Caspase-3(均为1∶1 000)4 ℃孵育过夜，阴性对照无一抗孵育，次日室温孵育45 min，加入荧光标记二抗Alexa Fluor 488-羊抗鼠抗体(Bcl-2)或Alexa Fluor 594-羊抗兔抗体(Bax和Caspase-3)(均为1∶500)，室温孵育1 h，使用50 mg/L DAPI 10 min复染核，缓冲甘油液封片，倒置相差荧光显微镜下拍照采集图像，运用Image-Pro Plus 6.0将绿色/红色荧光单色照片转换为黑色图片，选取图片中黑色作为判断阳性的统一标准，分析每张图片得出平均积分吸光度。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 远志汤对大鼠Morris水迷宫定位航行实验的影响

双因素重复测量的方差分析及其两两比较结果显示，模型组大鼠较对照组和假手术组逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P<0.01)，搜索距离明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。远志汤各剂量组大鼠逃避潜伏期和搜索距离均较模型组明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)，其中以高、中剂量组更为显著，详见表1、表2。

2.2 远志汤对大鼠Morris水迷宫空间探索实验的影响

与对照组和假手术组相比，模型组大鼠在原平台所在象限搜索时间明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)。远志汤各剂量组大鼠在原平台所在象限搜索时间均较模型组显著延长，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表3。

2.3 远志汤对慢性脑低灌注大鼠海马凋亡相关蛋白表达的影响

模型组大鼠海马Bax和Caspase-3的表达较对照组和假手术组有显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，Bcl-2的表达较对照组和假手术组则显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。使用远志汤高、中剂量干预后Bax和Caspase-3的表达显著减少(P<0.05)，而Bcl-2的表达显著增加(P<0.05)，而远志汤低剂量干预对Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的变化差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4、图1。

表1 各组大鼠Morris水迷宫实验逃避潜伏期比较Tab. 1 Comparison of escape latency of Morris water maze experiment in each group

Analysis of variance analysis for two-factor repeated measures (corrected by Greenhouse-Geisser): day:F=47.544,P=0.000; day×group:F=0.703,P=0.681; group:F=52.140,P=0.000.△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group at the same time point;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group at the same time point.

表2 各组大鼠Morris水迷宫实验搜索距离比较Tab.2 Comparison of search distance of Morris water maze experiment in each group

Analysis of variance analysis for two-factor repeated measures (corrected by Greenhouse-Geisser): day:F=51.261,P=0.000; day×group:F=0.855,P=0.713; group:F=78.276,P=0.000.△△P<0.01vscontrol group at the same time point;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group at the same time point.

表3 各组大鼠Morris水迷宫实验原平台象限活动时间比较Tab.3 Comparison of search time in the quadrant of the original platform in Morris water maze experiment in each group

表4 各组大鼠海马Bcl-2、Bax和Caspase-3含量比较Tab. 4 Level of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in hippocampus of each group

△P<0.05,△△P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.Bcl-2: B-cell lymphoma-2;Bax: Bcl-2 associated X protein;Caspase-3: cysteinyl aspartate specific proteinase-3.

图1 Bcl-2、Bax和Caspase-3在各组大鼠海马组织中的表达Fig.1 Expression of Bcl-2, Bax and Caspase-3 in hippocampus of rats in each group

Representative photomicrographs of immunofluorescence staining with an anti-Bcl-2(A), anti-Bax(B), anti-Caspase-3(C) antibody in hippocampus of rats in each group.1: control group;2: model group;3: sham operation group;4: Yuanzhi decoction high dose group;5: Yuanzhi decoction medium dose group;6: Yuanzhi decoction low dose group;7: donepezil hydrochloride group；Bcl-2: B-cell lymphoma-2;Bax: Bcl-2 associated X protein;Caspase-3: cysteinyl aspartate specific proteinase-3.

3 讨论

脑缺血尤其是老年人普遍存在的慢性脑低灌注与认知功能障碍的发生发展有着极为密切的联系[6]。中医理论认为，老年人年老体衰，肾精不足，脏腑得不到正常濡养，以致气血津液运行不畅，聚而生痰，痰浊日久，脑失所养，蒙蔽清窍，阻痹神明，表现为神情痴呆，语无伦次，遇事多忘等症。如《石室秘录·呆病》[7]云：“痰气最盛，呆气最深”，指出痰浊是本病的重要病机。本课题组从痰浊蒙蔽清窍入手，选用具有安神益智、开窍醒神功效的临床常用对药远志和石菖蒲，二者配伍应用，名曰远志汤。远志汤出自《圣济总录》[8]，远志性微温、味苦辛，长于祛痰开窍、安神益智；石菖蒲性温、味辛，善宣气除痰、开窍醒神；二药合用，相辅相成，使气自顺而壅自开，气血不复上菀，痰浊消散，不蒙清窍，而神志自清。

前期研究[9]以远志、石菖蒲为君药研制了院内制剂“脑康Ⅱ号”，临床观察发现脑康Ⅱ号能有效改善脑缺血致血管性认知障碍患者的学习、记忆功能。而应用中药小复方远志汤对慢性脑低灌注导致的认知功能障碍进行干预，既体现了中药复方“多成分、多靶点”的优势，又便于深入分析药物具体作用机制。实验研究[10-11]表明，远志汤的主要活性成分远志皂苷元以及石菖蒲的主要活性成分β-细辛醚均可以降低细胞凋亡率，保护海马神经元，增强实验动物的学习记忆能力等方面的作用[12-13]。

在慢性脑低灌注的情况下，脑组织血流降低和代谢异常，可导致脑关键部位(尤其是海马区)缺血、缺氧，诱发神经元损害，从而影响大脑的认知功能，而细胞凋亡是引起海马神经元数目减少的重要原因之一[14]。凋亡使神经元内多种与凋亡有关的基因或蛋白酶激活，其中Bcl-2是一种重要的抗凋亡蛋白，而Bcl-2相关X蛋白抗体Bax属于促凋亡蛋白。研究[15-16]表明，Bc1-2/Bax的比值决定着缺血、缺氧状态下细胞的存亡，另外，Caspase家族是一类直接引起凋亡细胞解体的蛋白酶系统，其活化是凋亡执行阶段的重要环节。该家族成员Caspase-3 是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶，处于凋亡级联反应的核心位置[17]。

本研究对大鼠采用双侧颈总动脉结扎术造模，以模拟慢性脑低灌注的发生，在Morris水迷宫定位航行实验中，模型组大鼠的逃避潜伏期和搜索距离较正常对照组明显延长；在空间探索实验中，模型组大鼠在原平台所在象限搜索时间较正常对照组明显缩短，说明模型组大鼠的空间学习记忆能力明显受损，造模成功。而远志汤可以明显缩短大鼠的逃避潜伏期和搜索距离，并延长在原平台所在象限搜索时间，表明远志汤可以提高慢性脑低灌注大鼠的空间学习记忆能力。免疫荧光检测结果显示，远志汤可以降低大鼠海马Bax和Caspase-3的表达，升高Bcl-2的表达，表明远志汤对慢性脑低灌注大鼠空间学习记忆能力的影响可能与其对海马凋亡相关蛋白表达的干预有关。中药复方中各有效成分往往通过多种药理途径和药效作用靶点，发挥防治疾病的作用[18-20]。因此，有必要开展进一步的研究，从不同角度深入分析远志汤干预慢性脑低灌注导致认知功能障碍的作用机制。