环介导等温扩增技术的应用及研究进展

徐 匆，罗华建，李艳芳，黄 皓，梁卫驱，胡 珊，胡楚维，罗鸿斌

（1. 东莞市农业科学研究中心，广东 东莞 523086；2. 东莞市理工学院生态环境工程技术研发中心，广东 东莞 523808）

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是 Notomi等［1］在 2000 年发明的一项能够在恒温条件下快速扩增DNA片段的技术，此方法利用针对靶序列中6个基因区段的2对引物及BstDNA polymerase在延伸DNA链的同时所具有的链置换活性，对目的片段进行链置换扩增，不需经过PCR反应时双链模板DNA的变性、退火及循环变温过程，扩增反应在恒温条件（61～65℃）下几十分钟即可完成(环引物的引入还可进一步缩短反应时间)。由于其快速、灵敏、对仪器要求低等特点，LAMP技术一经报道，便在食品安全、医学检验、种植、畜牧、水产等诸多行业的细菌、病毒、寄生虫等检测领域得到研究与应用［2-9］。

在传统LAMP的基础上，研究者陆续将其与多项技术联合使用，以扩展及增强LAMP技术的实用性及准确度，如与AMW反转录酶结合的反转录LAMP［10-11］，结合内切酶酶切技术的多重LAMP［6,12］，结合酶联反应的LAMPELISA［13-14］，结合实时定量等技术的多种LAMP产物检测法［15-17］等。本文就LAMP扩增技术与多种技术结合后的方法进行总结及举例说明和讨论，以期为相关人员提供参考。

1 可视LAMP研究

1.1 与DNA结合的染料

LAMP反应过程不断产生双链DNA，而SYBR Green I是一种能够结合在双链DNA双螺旋小沟区域的染料。游离状态时，SYBR Green I发出微弱荧光，肉眼观察呈橙色；与双链DNA结合后，荧光增强，肉眼观察呈绿色。因此，SYBR Green I也被利用于LAMP产物的检测。

Chen等［18］针对Maize chlorotic mottle virus（MCMV）保守的外壳蛋白序列设计了一套4条的LAMP引物，这套引物能够在60 min内实现对目的基因的检测。对LAMP产物进行检测时，发现使用SYBR Green I检测产物和使用凝胶电泳所检测到的RNA模板量都能达到2.5×10-6μg，敏感性比RT-PCR高10倍，且在对23株野外采集的玉米样本进行检测时，其敏感性也高于RT-PCR。

1.2 与离子结合的染料

钙黄绿素能够结合LAMP反应体系中的Mg2+，使体系颜色由黄变绿。Besuschio等［19］利用钙黄绿色这一特点结合LAMP技术检测人体血液中的克鲁兹锥虫，根据反应体系的颜色变化来判断检测结果。该法针对性地扩增高重复性的卫星序列，能从6个分型单位的克鲁兹锥虫扩增DNA，且成功从添加了EDTA和肝素的克鲁兹锥虫血液中检测到阳性，而在扩增地利什曼原虫、布鲁西氏杆菌、兰格利氏杆菌、恶性疟原虫和未感染的人类DNA时检测结果呈阴性，该法灵敏度可达到 1×10-2fg/μL DNA。

Irin 等［20］根据 HNB（Hydroxynaphthol blue）游离的负电荷能够与PEI正电荷结合生成蓝色沉淀这一反应开发了一种可以进行半定量检测的LAMP分析装置。该装置将PEI固定在纸上，然后把反应生成的LAMP产物滴至样品区间，再利用洗涤液将反应产物浸润到PEI区域，从而使得LAMP体系内的游离HBN与PEI结合而在纸上呈现出蓝色，根据纸上标记的距离能够进行反应模板的半定量分析（图1［20］）。这一装置成功检测到4.14×103拷贝/μL的E. coli基因组DNA。

图1 半定量检测的LAMP分析装置Fig. 1 LAMP analytical device for semi-quantitative detection

可视染料结合LAMP的优势：（1）可直接将染料添加进入反应体系，不需开盖检测；（2）裸眼可观察，不需借助仪器、设备。缺点：（1）染料的添加可能会抑制DNA合成的进行；（2）肉眼判断容易产生误差。

2 实时 LAMP研究

2.1 实时浊度LAMP研究

Mori等［21］在2003年根据LAMP反应过程会产生白色焦磷酸镁沉淀的性质，将real-time技术与LAMP技术结合，开发出浊度仪，在650 nm波长每隔30 s检测焦磷酸镁沉淀，结果显示当DNA模板初始浓度在2×103～2×109拷贝数的范围内时，反应时间与拷贝数对数呈线性相关，可用于核酸定量。LAMP实时浊度法由于实现了对扩增全过程的实时监控，比终点检测法效率更高、结果判定更准确、检测成本相对低廉，被广泛应用于多个领域。

Li等［4］以16S核糖体RNA基因的保守区为目的基因，使用LA-320c LAMP浊度仪（Eiken Chemical, Tokyo, Japan） 建立了检测细胞内劳森菌的LAMP技术。LAMP的最佳反应条件为65℃，反应时间为60 min，通过实时浑浊度检测和直接目视检测两种方法均能检测LAMP产物。LAMP的检测极限为1.4×10-1pg的DNA，与实时PCR检测极限相同，灵敏度约为常规PCR检测限的100倍。在136份临床标本中，有60份标本中的劳森菌DNA经LAMP检测与实时PCR检测结果一致，高于常规PCR检测结果（36.8%，50/136）。且该方法具有针对劳森菌的特异性，可作为诊断细胞内感染的一种有效的替代方法。

游淑珠等［22］同样采用LAMP实时浊度法针对产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC） stx1、stx2基因的特异性序列进行检测，LAMP反应能够在60 min内完成，且对非目的菌株检测时未出现特异性扩增，表现出良好的特异性。对食品样品的检测结果显示此方法具有较好的实际应用前景。

Arunrut 等［23］介绍了一种以 Laem-Singh 病毒（LSNV）为模型的单管、实时、反转录、环介导的RT-LAMP病原体检测装置的原型。以RNA聚合酶（RDRP）基因作靶基因，检测LAMP扩增后白色不溶性焦磷酸镁沉淀副产物形成的浑浊度。LSNV检测的优化方案是将样品管在65℃下孵育1 h，在此期间连续测量浊度，通过反应时间测量可得到定量结果。其检测灵敏度与常规套式逆转录-聚合酶链反应相当，与其他常见的虾病毒无交叉反应。该装置也可应用在现场或实验室环境下检测其他病原体。

2.2 实时荧光LAMP研究

2.2.1 基于荧光染料与双链DNA结合的实时荧光SYBR Green I、SYTO系列等染料在未和双链DNA结合时仅发出微弱荧光，结合后，荧光信号显著增强，根据这一特点，这些染料可被应用于DNA双链合成的监控与检测。

Lin等［24］对钩端螺旋体外膜蛋白lipl41基因进行LAMP扩增，并在体系中加入SYBR Green I，用MJ Opticon 2系统（MJ Research, MA, USA）对扩增曲线进行监测，可方便地判读结果。该法不依赖钩端螺旋体的分离培养，与其他细菌无交叉反应，检测的限约为100拷贝，与PCR和实时PCR相同。LAMP法简便易行，成本低廉，可用于对钩端螺旋体的快速、特异诊断。

Zeng等［25］使用SYTO 9作为核酸荧光染料对株猪塞内加谷病毒进行反转录荧光实时LAMP检测，最低检测限度为1 TCID50/ mL，比PCR和实时PCR分别低100倍和10倍；研究者对118份野外样品进行了检测，实时RT-LAMP、PCR、实时PCR的敏感性分别为71.2%、34.7%、64.4%，表明该方法适用于SVA的快速检测，具有较高的特异性、灵敏度和效率。这种实时RT-LAMP将是快速检测猪塞内加谷病毒感染和评估猪塞内加谷病毒对猪作用的流行病学研究的一种有用替代方法。

Seyrig等［26］认为LAMP现场诊断工具应具有需要体积小、功耗低、功能强大且价格低廉的光学组件以及节省试剂的小体积反应等特点，因此比较不同荧光染料的信噪比（SNR）或阈值时间（Tt）对于现场诊断工具的开发至关重要。他们对11种染料在LAMP荧光实时法中的应用进行了研究、评价，在所有测试的染料中，SYTO-82、SYTO-84和 SYTOX Orange的 Tt最 短， 而SYTO-81的工作浓度范围最广。检测应用时，10 min内可检测到10个结核分枝杆菌基因组拷贝，20 min内检测到10个肠道贾第鞭毛虫基因组拷贝，15 min内检测到10份金黄色葡萄球菌或肠沙门氏菌基因组拷贝。表明，反应效率取决于染料类型、浓度和所选聚合酶。

2.2.2 基于荧光共振能量转移的实时荧光 荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）原理是将荧光基团与淬灭基团配合使用，随着DNA扩增过程，荧光与淬灭基团之间的空间距离增大，FRET作用消失，荧光基团发出荧光。根据FRET原理，研究者可将基团固定在不同的碱基序列来发挥作用。

Wang等［6］将2套基团（HEX/BHQ-1,Cy5-BHQ-2）分别固定在针对志贺氏菌ipaH基因和沙门氏菌invA基因的FIP（Forward Inner Primer）引物两处，并在荧光基团和淬灭基团之间引入切刻内切酶Nb.BsrDI的酶切位点，随着反应进行，FIP与互补链形成双链结构，Nb.BsrDI能将连接有荧光基团的数个碱基从原链中切割出来，从而在荧光基团与淬灭基团之间形成一定的空间距离，检测到荧光基团的荧光信号。多重酶切实时LAMP法（MERT-LAMP）能在同一反应体系中对志贺氏菌及沙门氏菌DNA的检出限为62.5和125 fg，对菌株的检出限分别为5.8、6.4 CFU。在63 ℃恒温条件下，从19株志贺氏菌和14株沙门氏菌中提取基因组DNA，使用MERT-LAMP能在最短12 min内获得阳性结果，同时根据不同的荧光曲线实时识别出样品中存在的目标病原体。

Tanner等［27］在FIP上加入淬灭基团（Q-FIP），并设计一条与LAMP引物中的F1c引物互补的携带有荧光基团的Fd探针，先将FIP与Fd退火互补，再加入反应体系中，DNA扩征过程中Fd被置换出来，FRET效应消失。这种方法还能够扩展到LAMP反应中的外引物和内引物上。该方法具有高度的重复性和敏感性，可检测到少于100拷贝的人类基因组DNA。

还有研究者利用介质位移法（mediator displacement, MD）进行LAMP实时荧光，Becherer等［28］在LAMP体系中引入MD引物（包括具有Medc标签的LoopF引物，以及与Medc互补的Med序列）和一条携带有荧光和淬灭基团的通用报告分子（universal reporter molecules，序列内互补形成发卡结构，且含Medc片段和荧光及淬灭基团）。2条MD引物在反应前处于互补结合状态，随着反应进行Med被BIP（Backward Inner Primer）引物置换出来，被置换出来的Med再与广谱报告片段上的Medc区结合，破坏其环状结构，解除基团间的FERT状态（图2［28］）。在该研究中，MD检测技术被应用于HIV-1的RT-LAMP检测，并与基于分子信标(molecular beacon)的最新检测技术进行了分析设计和性能参数的比较，结果显示，MD的信噪比比MB检测高3倍，突出了使用通用报告分子的优势。这两种检测技术在检测限(MD:131copies/reaction，MB:141131copies/reaction)、重复性、再现性和线性(R2=0.94 for MD and MB)的结果类似。但MD检测在其简单的分析设计以及检测时间（阳性时间比MB短4.1 min）上都体现出了优势。在引入2套通用报告分子后，MD检测被成功应用在对HIV-1和HTLV-1的多重RT-LAMP以及杜克雷嗜血杆菌和梅毒螺旋体的多重LAMP检测上。MD检测可以与固定化的通用报告分子结合，还可以基于除了荧光外的不同信号生成方法。将来在MD技术还能够作为一种通用的检测技术扩展到使用链置换聚合酶的扩增方法上。

2.2.3 自我淬灭荧光 Nazarenko等［29］研究指出，荧光染料基团连接在寡聚核糖核苷酸链上时，其荧光信号与DNA链的初级及二级结构有关，当染料结合在引物的特定位点如3′末端的第二位T碱基时，荧光信号仅有正常信号的0.13。Gadkar等［30］在LAMP FIP引物3′末端的第二位T碱基处结合荧光基团，形成自淬灭荧光，用以检测人的Varicella-zoster病毒，敏感度和特异性分别达到96.8%及100%。

上述实时浊度及基于荧光染料与双链DNA结合的实时荧光相对其他实时方法而言操作简单，但仅适用于单一LAMP检测，对于多个检测目标并不适用；而基于FERT的实时荧光和自淬灭荧光则可以通过使用不同荧光基团的标记来进行多重LAMP检测。其中自淬灭荧光虽然需要的DNA片段更少，但由于其原理是基于DNA的初级及二级结构，因此对引物设计要求更高，背景噪音也会相对较高。基于FERT的实时荧光中包含了多种设计，有些设计较简单，如Wang等［6］未在体系中额引外入物新的DNA片段，仅需在FIP上5′端添加酶切位点及荧光、淬灭基团，使FIP本身形成FRET；在Tanner等［27］的研究中，需额外引入1条与FIP互补的DNA小片段，形成FRET；而Becherer等［28］的实验设计更为复杂，在体系中额外引入了2条DNA片段，但这2条DNA片段并不具有针对待检测目的片段的特异性，MD检测体系建立后可广泛地与多个LAMP结合，扩展后还能应用于其他DNA扩增技术，具有通用性。

3 微流控LAMP研究

3.1 传统微流控LAMP研究

微流控技术是20世纪90年代在毛细管电泳基础上发展起来的［31-32］，该技术集合多门学科，能够将复杂、多步骤的实验过程集成在单个芯片上，实现整个过程的集成化与微型化，具有少样品、快检测、高通量、自动化等优点。

Kaarj等［33］开发了一种利用反转录LAMP技术的蜡纸微流控芯片，对自来水、人尿和人血浆中寨卡病毒的检测证明了该技术的可行性，检测限低至1 拷贝/μL。该芯片对各种纸微流控芯片的纸型、孔径和通道尺寸进行了研究和优化，以确保在毛细管作用驱动流动过程中对直接使用的生物样品进行适当过滤。当寨卡病毒的RNA流到纸微流控芯片的检测区域，立刻添加带有pH指示剂的RT-LAMP混合物，用玻片密封，然后放置在68 ℃的热板上，可在15 min内观察到扩增后的颜色变化（由黄红色变为黄色），并通过智能手机测量绿色强度进行量化。该技术平台还可用于其他黄病毒，如基孔肯亚病毒和登革热病毒，以及其他可能快速传播的病毒病原体的现场诊断。

3.2 数字微流控LAMP研究

在微流控基础之上，数字微流控（Digital Microfluidics, DMF）技术逐步发展起来，与传统微流控技术相比，具有不依赖微泵、微阀、微混合器甚至三维流体通道等元件等优点，特别适用于生物微全分析体系［34］。

Tushar等［35］发明了一种以LAMP反应作为核酸扩增手段的数字微流控核酸检测系统，他们利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制备微流体装置，试剂（油相和样品）通过带有流量反馈的定制组装流量控制器（IDEX Health and Science，LLC）输送至装置，然后在装置上数字化成比色皿大小的液滴（图3）。孵化区保持在63℃，定制的共聚焦荧光光谱装置能够从通过设备检测区域的液滴中连续检测荧光，该系统能够达到每分钟9 000个液滴的处理量，且DMF-LAMP可进一步与毛细管连接，毛细管预先加载一系列样品塞，这些样品塞由油15（oil15）隔离，以便在单个装置上无缝处理多个样品。该研究以淋病奈瑟菌16S rRNA基因中的一段为检测的目的片段，实验中检测到的最低目标浓度为600 拷贝/μL。该检测限受多种因素影响，其中一个因素是中等强度的液滴在阈值化后，其中一部分被误判为阴性；此外，在阴性对照组中产生的假阳性非特异性扩增（大约为百万分之一到十个液滴）也限制了检测极限。这些问题可以通过优化LAMP反应来解决。

图3 数字微流控LAMP分析示意图［30］Fig. 3 The schematic diagram of droplet digital micro-fluidic LAMP analysis［30］

Wan等［36］开发了一种手持自动检测系统的无热DMF装置用于LAMP检测，液滴操作和实时温度控制系统集成在手持设备中，控制软件可以安装在任何平板电脑上。检测时将具有电润湿力的2 μL样品加载到夹层结构的DMF芯片中，能大幅降低试剂消耗。该研究以血寄生虫布鲁氏锥虫为模型，将2 μL样品加载至DMF芯片中，反应后加入高度浓缩的SYBR Green I，以避免反应液滴暴露在空气中引起气溶胶污染，每个反应能检测到40拷贝。这种低成本、紧凑的设备去除了用于DNA检测的笨重光学系统，非常适于非实验室测试。

微流控LAMP的优势在于能在极微小的封闭空间进行LAMP反应及结果检测，既能有效控制样品、试剂的使用量，又能实现高通量检测，对结果的判读准确，且能在密闭空间完成对产物的检测，避免产物形成气溶胶污染。

4 横向流及电化学LAMP研究

4.1 横向流LAMP研究

横向流（Lateral flow detect）是一种检测LAMP扩增产物的新方法, 包括核酸扩增（LAMP）、分子杂交（生物素标记的LAMP扩增产物与荧光素标记的探针杂交）及横向流检测（通过横向层析与试纸条上标记有荧光素抗体、生物素抗体及荧光素抗体抗体结合，从而在检测线和质控线上显示出特定颜色）3个步骤［37-38］。

Wang等［37］利用LAMP结合色谱侧流试纸检测强壮前沟藻的内转录间隔子基因，在LAMP引物FIP上标记生物素，同时对FIP和BIP之间的序列设计特异性探针（AC-HP），探针5′末端标记FITC。LAMP反应完成后，AC-HP加入生物素标记的反应产物中进行杂交，杂交产物加入LFD分析缓冲液后将试纸浸入，5 min后观察结果。整个过程可在70 min内完成检测，检测限约为10 cells/mL，敏感性与SYBY Green I LAMP相似，较传统PCR高出100倍。

刘露等［38］建立了草鱼呼肠孤病毒S8基因的横向流LAMP技术检测，与Wang等［37］工作原理类似，在内引物FIP上标记生物素，在探针上标记FAM。该体系的检测限为970 fg，完成检测所需时间为50 min，检测极限表现虽不如荧光定量PCR，但更为简单、快速、便捷。

横向流LAMP检测方法具有判读方便、需设备简单等特点，但其在反应完成后需要开盖进行杂交，这一步骤可能会引起污染，造成后续实验的假阳性。

4.2 电化学LAMP研究

电化学DNA传感器是生物传感器的一种，主要有基于特异序列、适体底物、小分子与结合蛋白、DNA分子的DAN传感器［39］。

Liu等［40］开发了一种基于回路介导的LAMP的实时电阻测量法，对LAMP反应体系进行了实时电阻监测和导数分析。该方法原理是LAMP反应产生两种负离子，即DNA和焦磷酸盐，它们与正离子染料结晶紫和Mg2+结合，导致反应液电阻率增加。利用专门设计的电阻电极实时测量艰难梭菌DNA的电阻率变化，艰难梭菌的电化学检测可以在0.5～1.0 h内完成，检测限为102 CFU/mL，与PCR方法相比，具有较高的准确度（95.0%）、灵敏度（91.1%）和特异性（97.3%）。

Hashimoto等［41］开发了一种新型电化学DNA芯片，利用GspSSD DNA聚合酶对插层氧化还原化合物具有一定耐受性的特点，对质粒上的细小病毒VP2基因序列进行实时电化学检测。以LAMP反应体系和钌铵(Ruhex)为插层氧化还原化合物，LAMP体系反应进行后产生的DNA能够与钌铵静电结合，电化学信号被放大，使用Corning®LSE™数字干浴加热器将电化学DNA芯片安装在定制的支架上，并在65℃下加热。通过电化学分析仪620和多化合物684（Alsco.，Ltd）线性扫描伏安法连续测量LAMP溶液中Ruhex的电压变化。随着阳性样品的LAMP反应，Ruhex的阴极峰值电流增加，峰值电位增加。利用这项技术，在103～106份目的核酸之间有良好的重复性，检出限为10 拷贝。电化学LAMP信号灵敏，结果判读简易，具有开发成为DNA检测芯片的潜力。

5 结语

LAMP技术的突出特点是能够在恒温条件下快速扩增DNA片段，这一特点决定此技术不需要昂贵仪器，且具有比常规PCR更高的敏感性，因此在核酸检测领域具有广阔的运用前景［42］。对于LAMP反应产物的检测，最初的方法是DNA凝胶电泳技术［1］，但使用此技术存在两个弊端：一是耗时，LAMP技术最大的优势之一是快速，对产物进行电泳检测将整体时间延长了20～30 min；二是假阳性，LAMP产物在开盖后易形成气溶胶污染实验环境，极易造成后续实验的假阳性，如能不开盖检测可有效避免检测结果的假阳性，增强其准确性。为了增强LAMP的实际应用能力，研究者们将多种技术与其相结合，以期能够开发出既能发挥LAMP优势，又能够避免其劣势的DNA检测技术。

目视LAMP费用低，适合多环境下使用；实时LAMP、微流控LAMP以及电化学LAMP法皆避免了开盖检测，有效提高了样品检测的准确度，且在通过实时监控反应进行程度可减少检测时间；横向流LAMP虽需要扩增产物暴露在空气中，但其具有可操作性强、便于判读等特点，同样具有实用价值。

LAMP的主要应用方向为人、动物、植物病原微生物的检测，但目前由于仍然存在短板如试剂相对昂贵、易造成假阳性、集成检测设备不成熟、模板需进行较为复杂的预处理等而极少被应用在野外检测。因此，LAMP未来的研究、应用发展方向可集中在研发集成式、体积小、操作便捷、通量高、易判读、低费用的手持式检测仪。