橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞的组织化学和分子生物学研究

谭德冠 彭晶 韩冰莹 付莉莉 孙雪飘 张家明

摘  要  橡胶树乳管分化研究主要以树皮为研究材料。本研究通过组织化学染色法、尼罗红荧光染色法、免疫组织化学法和分子生物学方法证实橡胶树叶柄来源的愈伤组织中存在乳管细胞。乳管细胞在叶柄愈伤组织中随机分布，分布模式类似橡胶树初生乳管;叶柄愈伤组织乳管细胞在发育早期时橡胶粒子较少，在发育后期时充满橡胶粒子。RT-PCR扩增出叶柄愈伤组织乳管细胞的橡胶延伸因子（REF）、小橡胶粒子蛋白（SRPP）、橡胶凝集素（hevein）和橡胶转移酶（CPT）等胶乳特异基因的转录本，经比对它们序列与所报道的橡胶树树干胶乳中表达的基因序列一致，表明橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞拥有树皮乳管细胞相似的功能，为叶柄愈伤组织作为一种新型的研究乳管分化的模式提供了科学依据。

关键词  橡胶树;叶柄愈伤组织;乳管细胞;乳管分化;研究模式中图分类号  Q949.748.5      文献标识码  A

Histochemical and Molecular Characterization of Laticifer Cells in Calli Derived from Petioles of Rubber Tree

TAN Deguan， PENG Jing， HAN Bingying， FU Lili， SUN Xuepiao， ZHANG Jiaming^*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Crop Biology and Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract  The trunk bark of rubber tree （Hevea brasiliensis） is usually used as the material for the study of laticifer differentiation. In this study， we confirmed the presence of laticifer cells in petiole-derived calli by histochemical staining， nile red fluorescence staining， immunohistochemistry and molecular biology. Laticifer cells in petiole-derived calli were distributed randomly， similar to the primary laticifers. They contained less rubber particles in the early developmental stage， and were full of rubber particles in the late developmental stage. The laticifer-specific genes including REF， SRPP， Hevein and CPT were confirmed to be expressed from the petiole-derived callus by RT-PCR， and their transcripts were the same as those reported in the latex of the trunk barks. These results indicated that the laticifer cells in the petiole-derived calli and in barks had similar functions， which would provide a basis for petiole-derived callus as a novel research model to study laticifer differentiation in the rubber tree.

Keywords  rubber tree （Hevea brasiliensis）; petiole-derived calli; laticifer cells; laticfer differentiation; research model

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.011

乳管是一種高度特化的细胞，是植物贮存和合成胶乳的场所。全球共有22个属12 500种植物含有乳管细胞，但只有橡胶树来源的胶乳才具有商业开发价值^[1]。橡胶树是一种重要的热带经济林木，由于其胶乳具有产量高、易收集等优势，占全球天然橡胶的产量99%^[2]。乳管细胞的数量与橡胶树的产量正相关^[3]，因此研究如何促进乳管细胞分化从而提高橡胶树的产量是橡胶树科研人员的重要课题。目前橡胶树乳管分化的研究主要以树皮为研究模式，但树皮模式易受大田环境（温度、光照、土壤等）的影响，实验重复性差;且从种植至开割需7年之久，研究周期长。这些客观原因导致乳管分化的研究进展缓慢。

Tan等^[4-5]发现来源于花药的愈伤组织存在乳管细胞，并提出了花药愈伤组织可作为一种研究乳管分化的新模式。花药愈伤组织模式具有环境条件可控制、实验周期短、重复性好的优势，可克服树皮乳管模式的缺点。但由于橡胶树一年只有3次花期（春花、夏花、秋花），且每次雄花花期为15 d左右^[6]，导致采用花药愈伤组织模式研究乳管分化受采样时间的限制。橡胶树的枝条顶端被剪后，10 d左右新的幼嫩枝条就会从其腋芽中抽出。因此采用橡胶树幼嫩的叶柄作为外植体来诱导愈伤组织不受采样时间的限制。然而目前尚不清楚叶柄来源的愈伤组织中是否也存在乳管细胞。本研究通过组织化学法、尼罗红荧光染色法、免疫组织化学法和分子生物学法验证叶柄愈伤组织中是否存在乳管细胞，为叶柄愈伤组织能否作为研究乳管分化的新模式提供科学依据。

1  材料与方法

1.1材料

采用橡胶树品种热研7-33-97盆栽芽接苗，种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所温室。去除枝条顶端，10 d后采集从腋芽中新抽出的处于古铜期枝条的叶柄作为外植体。

1.2方法

1.2.1  叶柄愈伤组织的诱导  将幼嫩的叶柄剪成3 cm长，于超净工作台中70%酒精消毒1 min，0.15%升汞消毒10 min，无菌水清洗5遍。将消毒好叶柄切成1 cm小段，接种于愈伤诱导培养基中。基本培养基为MS培养基，附加2，4-D 2 mg/L、 NAA 0.5 mg/L、6-BA 1 mg/L、蔗糖80 g/L和植物凝胶2.5 g/L，pH调整至6.0。在黑暗条件下25 ℃培养80 d。

1.2.2  组织化学染色法  组织化学染色法参照田维敏等^[7]介绍的方法进行。分别将10龄的热研7-33-97树干树皮、枝条树皮和培养80 d的叶柄愈伤组织块室温条件下于80%酒精固定2 d，将固定好的材料经酒精系列脱水，冰醋酸过渡4 h，60 ℃下溴-碘溶液（冰醋酸100 mL，碘5 g，溴液0.4 mL）处理42 h。溴-碘溶液处理后的材料经正丁醇透明，石蜡包埋与切片，切片厚度10 ?m片。经二甲苯浸泡切片2次，后用固绿溶液（1 g固绿溶于100 mL 95%酒精）染色，光学显微镜下观察切片。

1.2.3  尼罗红荧光染色法  尼罗红荧光染色法参照Sando等^[8]报道的方法进行。将培养80 d的叶柄愈伤组织块切成1 mm×1 mm的小块，80%酒精固定6 h，1 mol/L盐酸60 ℃水浴锅中处理18 min，6000?g离心5min后弃除上清，ddH₂O清洗愈伤细胞2次，每次3 min，6000?g离心5 min收集愈伤细胞。将处理好后的愈伤细胞浸于50 ?g/mL的尼罗红溶液（Sigma）中10 s，ddH₂O清洗2次，将愈伤细胞均匀涂布于载玻片上，指甲油封片，于荧光显微镜下观察，紫外光波长为420～490 nm。

收集10龄的热研7-33-97胶乳于冰浴的离心管中，加入4倍体积的含等渗液（10 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L蔗糖，pH 7.0）的尼罗红溶液（50 ?g/mL）处理10 s，12 000?g离心10 min后收集上层漂浮物，等渗液清洗2次，将处理后的胶乳物质均匀涂布于载玻片上，指甲油封片，于荧光显微镜下420～490 nm观察。

1.2.4  免疫组织化学法  免疫组织化学法参照Tan等^[4]报道的方法进行。将固定好的80 d叶柄愈伤组织块进行石蜡包埋切片，切片脱蜡后复水，置于0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液中于95 ℃下处理15 min来修复抗原，PBS清洗3次，2%牛血清蛋白处理30 min。加入一抗[兔抗小橡胶粒子蛋白（SRPP）抗体，或兔抗橡胶延伸因子蛋白（REF）抗体]（兔抗SRPP、兔抗REF由中国热带农业科学院热带生物技术研究所王旭初课题组提供）（按1∶100稀釋）于切片中，将切片置于密封的培养皿中4 ℃下孵育过夜。PBS清洗3次，加入二抗（羊抗兔，螯合碱性磷酸酶），37 ℃孵育1 h，PBS清洗5次。切片用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色液处理5 min，PBS清洗5次，酒精系列脱水，二甲苯透明，封片后在光照显微镜下观察。

1.2.5  RT-PCR扩增叶柄愈伤组织中乳管特异表达基因  取培养80 d的叶柄愈伤组织块用植物RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取其RNA，第一链cDNA采用反转录cDNA试剂盒（Fermentas）进行合成。橡胶延伸因子（rubber elongation factor，REF）、小橡胶粒子蛋白（small rubber particle protein，SRPP）和橡胶转移酶（cis-prenyl transferase，CPT）基因是橡胶树乳管细胞特异表达的与胶乳合成相关的基因^[9-11];橡胶凝集素（Hevein）是胶乳中最丰富的蛋白，具有防御等功能^[12]。通过NCBI网上查询，获得了该4个基因在橡胶树树皮胶乳的cDNA序列。它们在GenBank的登录号分别为HQ640230、HQ640231、EU675683和AY247790。根据它们的序列应用DNAMan软件设计相应的扩增引物，其中REF-F：5′-GAAGACGA AGACAACCAAC AA G -3′，REF-R：5′-AAGCCAGAAAACGAGCAG-3′;SRPP-F：5′-GGCTGAAGAGGTGGAGGA-3′，SRPP -R：5′-GGGCAACAAAGGCAAATA-3′;CPT-F：5′-AAGGTCCCATCCCTACTCAT-3′，CPT-R：5′- T AGACGGCTCAACCCAGA-3′;Hevein-F：5′-A TAACCTATGTTGTAGCCAGTG-3′，Hevein-R：5′- TGACCTCGTTCATATCCTTT-3′。PCR产物经DNA纯化试剂盒（宝生物）纯化后送至华大基因测序，对测序结果进行Blast比对。

2  结果与分析

2.1组织化学法鉴定叶柄愈伤组织中乳管细胞

溴-碘组织化学染色法是一种经典的鉴定植

物乳管细胞的方法，乳管细胞的内含物被染成棕红色，易于鉴别，被广泛应用于橡胶树树皮乳管分化研究中^[13]。本研究采用该方法对10龄的热研7-33-97树干树皮及其枝条的树皮进行染色，发现树皮中的乳管细胞的内含物均被染成棕红色（图1A，图1B）。成龄树树干树皮与枝条树皮的乳管细胞存在分布上的差异，前者来源于形成层的次生分生组织，为次生乳管^[14]，在韧皮部中成列分布，不同的乳管列之间相互平行（图1A）;而后者来源于顶端分生组织，为初生乳管^[14]，在组织中随机分布（图1B） 。

叶柄在愈伤组织诱导培养基中培养80 d后，其所分化出的愈伤组织为鲜黄色，质地紧密，表面有些颗粒状小突起（图1C）。对该愈伤组织进行溴-碘组织化学染色，显微镜下观察到一些呈棕红色的细胞（图1D），表明这些细胞为乳管细胞。愈伤组织中乳管细胞的颜色较次生乳管颜色深，而与初生乳管细胞颜色相近;其分布是随机的，有些乳管细胞相聚在一起，但大部分乳管细胞是单个的（图1D），与初生乳管分布方式相近。愈伤组织存在单宁细胞，经溴-碘染色后变为黑色;

同时还存在淀粉细胞，该细胞内含有较多的淀粉粒（图1D）。部分愈伤组织乳管细胞的内含物收缩明显，聚集于乳管细胞的中央处，这可能是在制片过程中经各种试剂处理，胶乳变性收缩所造成的。

2.2 尼罗红荧光染色法鉴定叶柄愈伤组织中乳管细胞

橡胶树的乳管细胞主要含有橡胶粒子、黄色体、F-W复合体、线粒体等，乳管被开割后，这些物质从乳管细胞中流出，形成胶乳^[15]。其中橡胶粒子是胶乳的主要成分，1 mL胶乳中含有4.7× 10¹³个橡胶粒子^[16]。在可见光下，胶乳中的橡胶粒子为极小的颗粒，经尼罗红染色后，在荧光条

件下橡胶粒子呈现为黄色的小颗粒（图2A）。叶柄愈伤细胞经1 mol/L盐酸的处理后，通过尼罗红荧光染色法发现一些细胞中有黄色小颗粒（图2B），表明该细胞含有橡胶粒子，应为乳管细胞。同时也发现愈伤组织中存在管状的乳管（图2C），是由多个相邻乳管细胞相互融合贯通形成的，乳管细胞融合贯通后所形成的乳管充满了橡胶粒子，尼罗红染色后在荧光条件下整个乳管呈现黄色（图2C）。图2B中的乳管细胞为乳管细胞发育早期，所含的橡胶粒子较少，而图2C中的相互融合贯通的乳管细胞为乳管细胞发育的晚期，乳管细胞内充满了橡胶粒子，这也表明乳管细胞发育的过程是个橡胶粒子不断形成增多的过程。

2.3免疫组织化学法鉴定叶柄愈伤组织中乳管细胞

橡胶树乳管细胞含有特异的SRPP和REF。石蜡切片的叶柄愈伤组织经含有兔抗SRPP或REF的一抗处理后，再与螯合有碱性磷酸酶显色基团的羊

抗兔二抗相结合，经BCIP/NBT碱性磷酸酶显色液显色后，观察到染成蓝黑色的细胞，为含有SRPP和REF的细胞。由于SRPP和REF在乳管细胞中特异表达，因此蓝黑色细胞为乳管细胞，其内含物收缩明显;而非乳管细胞没有被染上颜色（图3）。

2.4  RT-PCR扩增叶柄愈伤组织胶乳特异基因

在本研究中，REF、SRPP、Hevein和CPT基因片段均能从橡胶树叶柄愈伤组织的cDNA中扩增出来，RT-PCR产物经测序后分别为355、571、439、653 bp（图4）。对测序结果进行Blast比对，发现从叶柄愈伤组织中所扩增出来的4个胶乳特异基因的转录本序列与所报道的橡胶树树皮胶乳中表达的基因序列一致，进一步从分子水平证实了叶柄愈傷组织存在乳管细胞，且这些乳管细胞与树皮乳管细胞功能相似。

3  讨论

溴-碘染色的组织化学法可使植物组织中乳管细胞的橡胶变成不溶于二甲苯的棕红色物质，从而鉴定出乳管细胞^[13]。尼罗红染色荧光法通过尼罗红染料与脂类物质相结合而发出荧光检测信号，植物乳管细胞的胶乳含有脂类物质，可通过该方法来鉴定植物乳管细胞^[8]。但橡胶树愈伤组织细胞具有自发的荧光物质^[17]，如果直接采用尼罗红荧光染色法来鉴定叶柄愈伤组织中乳管细胞，势必会有背景荧光的假阳性干扰。本研究用1 mol/L盐酸60 ℃条件下处理叶柄愈伤组织细胞，发现能够去除愈伤组织细胞的自发荧光物质，同时发现橡胶粒子与尼罗红染料结合，在紫外光条件下橡胶粒子显示黄色荧光。免疫组织化学法利用抗原与抗体具有高度特异性结合的特点，通过化学反应使标记抗体的显色基团显示出来，从而确定组织细胞的抗原，并对其进行定性、定位和定量研究^[18]。本研究利用SRPP或REF的特异一抗处理愈伤组织细胞，愈伤组织中的乳管细胞的底物SRPP或REF与一抗特异结合，再经含显色基团的二抗处理，经显色处理后乳管细胞呈现蓝黑色。本研究综合上述3种方法来鉴定叶柄愈伤组织乳管细胞，为证实叶柄愈伤组织存在乳管细胞提供了依据。

在本研究中叶柄愈伤组织的乳管细胞分布模式与Tan等^[4]报道的花药愈伤组织乳管细胞的相一致，均为随机分布，表明两者分化方式相似。叶柄含有乳管细胞，以其为外植体所诱导出的愈伤组织的乳管细胞的来源尚不清楚，可能来源于愈伤组织中的薄壁细胞，也可能来源于叶柄乳管细胞，因此需对叶柄愈伤组织中乳管细胞的整个发育过程进行系统研究。

REF、SRPP、CPT是存在于小橡胶粒子膜的蛋白质，是参与橡胶树橡胶合成的重要酶和调控因子^[9-11]。Hevein存在于橡胶树黄色体中，乳管被开割后黄色体破裂被释放出来，具有凝固胶乳和防御病原菌的功能^[12]。本研究從叶柄愈伤组织中扩增出该4个胶乳特异表达基因的转录本，且发现它们的序列与树皮乳管细胞的相一致，表明叶柄愈伤组织乳管细胞与树皮乳管细胞功能相似，这为叶柄愈伤组织作为研究乳管分化的新模式提供了科学依据。

致谢中国热带农业科学院热带生物技术研究所王旭初课题组为本研究提供兔抗SRPP抗体、兔抗REF抗体，特此致谢！

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