果酒酵母和异常维克汉姆酵母混菌发酵复合水果的风味物质特征

刘丛竹 郭波布 安琪 等

摘要 [目的]以麦芽汁、火龙果、葡萄、菠萝组合的复合果汁，通过果酒酵母和异常维克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）混菌发酵得到一种具有红酒风味特征的复合果酒。[方法]以红酒风味指标为标准，测定发酵酒的酒精度、还原糖、总酸等理化指标，以及乙酸乙酯、高级醇、有机酸等主要风味物质，并进行感官评价。[结果]复合果酒的主要风味特征指标符合红酒风味标准，酒精度为10.5%（体积比），混菌发酵比果酒酵母单菌发酵更快，酒中乙酸乙酯含量提高了32.10%，达50.55 mg/L，高级醇含量提高到251.09 mg/L，总有机酸降低到4.94 g/L。[结论]通过混菌发酵复合果汁获得具有红酒风味特征的复合果酒，这为南方水果的复合果酒酿造提供了新思路。

关键词 混菌发酵;异常维克汉姆酵母;复合果酒;风味物质

中图分类号 TS262.7文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）04-0162-03

Abstract [Objective]A composite fruit juice composed of wort， dragon fruit， grape and pineapple was fermented by fruit wine yeast and Wickerhamomyces anomalus yeast to obtain a composite fruit wine with red wine flavor characteristics. [Method]With the red wine flavor index as the standard， the physical and chemical indicators such as alcohol content， reducing sugar and total acid of fermented wine， as well as main flavor substances such as ethyl acetate， higher alcohol and organic acid were determined，sensory evaluation was carried out. [Result]The main flavor characteristics of compound wine were in line with the red wine flavor standard. The alcohol content was 10.5%（volume ratio）.The fermentation of mixed bacteria was faster than the single bacteria fermentation of wine yeast， and the ethyl acetate content in wine increased by 32.10% to 50.55 mg/L. The higher alcohol content was increased to 251.09 mg/L， and the total organic acid was reduced to 4.94 g/L. [Conclusion]The composite fruit juice with red wine flavor characteristics was obtained by mixed fermentation of mixed fruit juice， which provided feasibility for the composite fruit wine brewing by southern fruits.

Key words Mixed fermentation;Wickerhamomyces anomalus;Composite fruit wine;Flavor substance

復合果酒通常是2种或2种以上的水果按一定的比例混合，经过液态发酵酿造出的一种新型果酒。近年来，对非酿酒酵母的研究表明，这些酵母对酿酒过程有很大影响，能增强和改善葡萄酒的感官特性[1]。异常维克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）作为非酿酒酵母，在芒果酒等果酒、白酒及面包发酵等各方面都有应用，且效果俱佳[2]。You等[3]从宜宾浓香型白酒产区分离了大量功能酿酒酵母，其中1株异常维克汉姆酵母菌体现了很好的产酯能力。Martínez等[4]将麦芽汁与柿子汁以1∶1比例混合，经酿酒酵母发酵后的口感较佳，风味物质含量特征都较好。笔者用麦芽汁代替部分果汁，节省原材料费用的同时可以为酵母提供丰富的碳氮源，用红心火龙果增添果酒颜色，用菠萝增香，果酒酵母和异常维克汉姆酵母混菌发酵得到一种符合红酒风味标准的新型复合果酒，并就异常维克汉姆酵母菌对复合果酒的风味物质特征影响做了定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。实验室分离和鉴定的异常维克汉姆酵母;果酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为实验室保存。

1.1.2 培养基与发酵液。YPD 培养基：葡萄糖 20 g/L、酵母浸膏 10 g/L、蛋白胨 20 g/L。

复合果汁的制备：将新鲜洗净的葡萄、红心火龙果、菠萝果肉分别榨汁。将22 °P的麦芽汁[5]、葡萄汁、火龙果汁、菠萝汁按3∶1∶1∶1混合。用白砂糖、食用酒石酸调糖度为200 g/L，pH 3.4。

1.2 方法

1.2.1 菌液活化。将2种酵母菌接种至50 mL YPD液体培养基中活化，再转接至YPD固态培养基上，28 ℃恒温培养至形成单菌落，然后挑取单菌落接种至YPD液体培养基中，28 ℃恒温扩培2 d，4 ℃保存备用。

1.2.2 发酵条件优化。

1.2.2.1 确定异常维克汉姆酵母菌接种比例。将果酒酵母以1×106 CFU/mL接种于复合果汁中，再分别接种0、4×104、2×105、4×105、1×106 CFU/mL的异常维克汉姆酵母，22 ℃静置发酵7 d，然后测定发酵酒中的酒精度和乙酸乙酯含量。

1.2.2.2 发酵时间的优化。将复合果汁接种1×106 CFU/mL果酒酵母（纯菌）和同时接种1×106 CFU/mL果酒酵母、2×105 CFU/mL异常维克汉姆酵母菌（混菌），22 ℃静置发酵7 d，每隔24 h取样，测定还原糖。

1.2.2.3 优化条件下发酵复合果酒及其成分测定。将复合果汁接种1×106 CFU/mL果酒酵母（纯菌）和同时接种1×106 CFU/mL果酒酵母、2×105 CFU/mL的异常维克汉姆酵母菌（混菌），22 ℃静置发酵7 d，然后测定发酵酒中高级醇、有机酸和滴定酸含量，并进行感官评价。

1.2.3 酿造果酒的理化指标检测。

1.2.3.1 酒精度。通过GB 15038—2006-T，采用酒精计法测定发酵液的酒精度[6]。

1.2.3.2 滴定酸。通过GB 15038—2006-T，采用酸碱滴定法（以酒石酸计）测定发酵液的滴定酸[6]。

1.2.3.3 还原糖。通过GB 15038—2006-T，采用DNS测还原糖法测定发酵液的还原糖含量[7]。

1.2.4 挥发性风味物质检测。通过内标法测定发酵产物中的乙酸乙酯和高级醇含量。样品前处理：取50 mL样品加入50 mL蒸馏水于250 mL蒸馏瓶中蒸馏，得50 mL蒸馏液。色谱条件为色谱柱 Agilent DB-WAX 122-7032：250 ℃、30 m×0.25 μm×0.25 mm;起始柱温为50 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至200 ℃保持3 min;载气为高纯氮气（纯度为 99.999%）;检测器温度为250 ℃，氢气流速为30 mL/min，空气流速为350 mL/min，尾吹速度为30 mL/min，分流比为 30∶1;进样量为1 μL[8]。

1.2.5 有机酸检测。通过外标法测定发酵产物中的有机酸含量。样品前处理：将样品高速冷冻离心（10 000 r/min，10 min）取上清液，用流动相稀释10倍，过0.22 μm孔径滤膜。色谱柱：Agilent C18色谱柱 （4.6 mm × 250 mm ID，5 μm）;流动相：0.01 mol/L KH2PO4缓冲溶液（用磷酸调至pH为2.8）过 0.45 μm水系滤膜，流速 0.7 mL/min;柱温25 ℃;检测波长210 nm;进样量10 μL[9]。

1.2.6 感官评价。由20名评委（10名女性和10名男性）品尝，对该复合果酒进行感官评价。取样品上清澄清液（20 mL）于酒杯中，按随机顺序给评委品尝。在测试过程中，建议用饮用水冲洗上颚。对颜色、香气、口感、酸度、风味和整体可接受性的得分有9个类别（1极度厌恶;2很不喜欢;3比较不喜欢;4略微不喜欢;5不喜欢也不讨厌;6略微喜欢;7比较喜欢;8很喜欢;9非常喜欢）。记录各项得分并绘制所有属性的平均值[10]。

1.2.7 数据处理。应用单因素方差分析对数据进行统计分析。其显著性差异采用 SPSS 19.0 软件中的 Duncans新复极差法进行分析（P<0.05）。采用Origin 9.0软件对数据进行做图分析，其数值以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 异常维克汉姆酵母接种量的确定

由图1可知，混菌发酵的酒精度為10.5%（体积比），而纯菌发酵后的酒精度只有8.5%。混菌发酵过程中，酒精度不因异常维克汉姆酵母的接种量而改变。说明整个发酵过程中果酒酵母占主导作用，且异常维克汉姆酵母对果酒酵母发酵性能有促进作用。随着异常维克汉姆酵母接种量的增大，发酵液中乙酸乙酯的含量随之增多。当异常维克汉姆酵母接种量为1×106 CFU/mL，乙酸乙酯的产量最高，高达321.58 mg/L;接种量为2×105、4×105 CFU/mL时，其发酵酒中乙酸乙酯含量分别为50.55、91.05 mg/L。当接种量为4×104 CFU/mL时，与果酒酵母单独发酵所产的乙酸乙酯含量（38.27 mg/L）没有显著性区别。当果酒中乙酸乙酯含量在80 mg/L以下，此化合物对果酒芳香有增益作用[11]。确定异常维克汉姆酵母菌的接种量为2×105 CFU/mL，其乙酸乙酯含量50.55 mg/L，比纯菌发酵提高了32.10%，符合红酒的品质标准（22.5～63.5 mg/L）[12]。

2.2 纯菌与混菌发酵的变化规律

由图2可知，纯菌和混菌发酵自第6天后，发酵液中还原糖含量无显著差异，说明2种发酵方式中酵母不再耗糖发酵，基本都已发酵稳定，因此确定发酵时间为7 d。发酵第1天，纯菌的耗糖速率比混菌的快;第1～2天，混菌发酵液中还原糖含量急速下降，耗糖速率剧增;发酵第2～7天，纯菌与混菌耗糖速率逐渐平稳，但混菌发酵的耗糖速率一直比纯菌的快。说明异常维克汉姆酵母菌可以促进果酒酵母代谢，以提升其发酵力。混菌发酵结束后残糖量为10 g/L，略高于成品干型红酒的残糖量指标（≤4 g/L）[13]。

2.3 优化条件下混菌发酵对复合果酒风味物质的影响

2.3.1 混菌发酵对复合果酒中高级醇的影响。

果酒发酵过程中产生的主要醇类有异戊醇、异丁醇和β-苯乙醇[13]。由表1可知，混菌发酵产生的异戊醇、异丁醇比纯菌发酵的产量分别高出8.93、5.20 mg/L，这表明异常维克汉姆酵母菌在混菌发酵中提高了异戊醇、异丁醇的生成量。该研究中混菌发酵产物中高级醇含量为251.09 mg/L，较纯菌发酵产量（234.20 mg/L）提高了7.21%，但其值在300 mg/L以下[14]，对果酒的香气和品质有增益作用。而β-苯乙醇的含量在纯菌和混菌发酵中没有显著性差异，其含量为37～42 mg/L，符合红酒气味指标范围（4～190 mg/L）[12]。

2.3.2 混菌发酵对复合果酒中酸类的影响。

表2测定了2种不同发酵方式下果酒中的滴定酸和有机酸。它们的滴定酸含量在统计学上无显著差异，在4.2～4.4 g/L（以酒石酸计）。这与Pedro M.等[15]在异常维克汉姆酵母菌对红酒的影响研究中测得的红酒滴定酸的值（4.7～4.8 g/L）相近。混菌与纯菌发酵液中主要有4种有机酸，其中酒石酸、乳酸、柠檬酸含量在统计学上没有显著差异性，其含量分别在0.8～1.2、1.5～2.0、0.8～1.5 g/L。但是，2种发酵方式产的苹果酸含量在统计学上有显著性差异。混菌发酵的果酒中苹果酸含量比纯菌发酵的低，但是两者乳酸产量几乎一样，说明苹果酸含量的差异与苹果酸-乳酸发酵没有关系，可能是受到异常维克汉姆酵母菌的影响导致混菌发酵产物中苹果酸含量比纯菌发酵的低。同时，混菌发酵的有机酸总酸值相比纯菌发酵的值更低，这可以很好地提高果酒的芳香品质[16]。

2.4 感官评价

由图3可知，异常维克汉姆酵母和果酒酵母混合发酵相比果酒酵母单独发酵的产品感官评价得分更高，其整体可接受性得分7.68，颜色得分8.09，香气得分7.94，酸度得分6.42，口感得分7.58，风味得分7.35。结果表明，混菌发酵的发酵产品相对单菌发酵的口味更受欢迎，酒体澄清透明，颜色呈现红宝石般明亮红色，果香浓郁，果香与发酵味较为融合，味道偏酸，口感较丰富。

3 结论

该研究将麦芽汁、火龙果、葡萄、菠萝按一定比例混合，糖度为200 g/L、pH为3.4，同时接种异常维克汉姆酵母2×105 CFU/mL和果酒酵母1×106 CFU/mL，22 ℃发酵7 d，得到复合果酒的酒精度为10.5%，相比纯菌发酵提高了23.5%，乙酸乙酯含量为50.55 mg/L，高级醇总含量为251.09 mg/L，相比纯菌发酵分别提高32.10%和7.21%，总有机酸略微降低至4.94 g/L，使釀造果酒的口味更优良，且其主要风味指标都符合红酒指标标准。该研究中通过异常维克汉姆酵母和果酒酵母混菌发酵复合果汁获得具有红酒风味特征的复合果酒，澄清透亮，具有典型的果酒香味和风格，这为南方水果的复合果酒酿造提供了可行性。用麦芽汁代替部分果汁进行发酵，其对菌体生长和发酵的影响尚待进一步研究。

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