百合鳞茎青霉病菌对不同药剂敏感性测定

杨士杰 占军平

摘要 [目的]研究百合鳞茎青霉病菌对不同药剂的敏感性。[方法]以嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲环唑、丙环唑为试剂，每个试剂均设置0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、100.00  μg/mL 6个浓度，采用菌丝生长速率法，将供试百合鳞茎青霉病菌单孢菌株在含药平板上分别进行敏感性测定。[结果]醚菌酯和丙环唑对百合鳞茎青霉病菌抑制率较高，苯醚甲环唑和嘧菌酯抑菌率相对较低。百合鳞茎青霉病菌对醚菌酯的EC50小于敏感菌株标准值0.455 μg/mL，百合鳞茎青霉病菌对醚菌酯敏感;百合鳞茎青霉病菌对丙环唑和苯醚甲环唑的EC50分别为0.471和0.541 μg/mL，均略大于敏感菌株标准值0.455 μg/mL，介于0.455～0.911 μg/mL，百合鳞茎青霉病菌对丙环唑、苯醚甲环唑敏感性相对较低，即病菌对这2种药剂均表现为低抗;百合鳞茎青霉病菌对嘧菌酯的EC50为8.185 μg/mL，大于高抗标准值3.644 μg/mL，是敏感菌株标准值0.455 μg/mL的17.98倍，即病菌表现为高抗。[结论]该研究为合理选用药剂、防治百合鳞茎青霉病提供参考。

关键词 百合鳞茎青霉菌;敏感性测定;醚菌酯;嘧菌酯;苯醚甲环唑;丙环唑

中图分类号 S436.8+1文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）04-0147-03

Abstract [Objective]To study sensitivity of lily bulb penicillium to different fungicides.[Method]Using pyrimidine，ether ester，phenyl ether methyclozole，procyclazole as reagents，each reagent was set at 0.01，0.10，1.00，5.00，10.00，100.00 μg/mL concentration，using mycelial growth rate method，the sensitivity of the single spore strain of Lilium miltiorrhiza viridis was determined on the tablet containing the drug.[Result]The inhibition rate of ether ester and procyclole was higher and that  of benzene ether mezazole and pyrimidine was lower.Through regression analysis，the EC50 of Lilium mildew was less than the standard value of 0.455 μg/mL of the sensitive strain，so the Lilium mildew was sensitive to Ethericum;The EC50 of Lilium miltiorrhiza was 0.471 and 0.541  μg/mL，respectively，slightly higher than the standard value of 0.455 μg/mL of sensitive strains，between 0.455 and 0.911 μg/mL，Therefore，the sensitivity of Lilium miltiorrhiza to procyclazole and diphenyl ether was relatively low，that was，the bacteria showed low resistance to both of these agents;The EC50 for pyrimidine esters was 8.185 μg/mL，which was greater than the high resistance standard value of 3.644  μg/mL.It was 17.98 times the sensitive strain standard value of 0.455 μg/mL，that was，the pathogen was highly resistant.[Conclusion]The study provide a reference for the rational selection of pharmaceutical and prevention and treatment of Lily bulb green mildew.

Key words Penicillium buld penicillium;Sensitivity test;Diazoate;Azoxazole;Diphenoxazole;Paclobutrazol

百合鱗茎青霉病常发生于贮藏期，该病主要危害百合鳞茎[1]。当百合鳞茎表面有该病菌且在储藏期间遇到高温、高湿的情况后，病菌就会大量繁殖。病菌从伤口侵入，后迅速进入鳞茎内部，使其失去价值，造成巨大损失[2]

，贮藏后期百合逐渐衰弱也给该病蔓延创造了条件[3]。据统计，在储藏期间百合鳞茎青霉病平均感染率在50%以上，严重时甚至可达100%。针对百合鳞茎青霉病这一严重问题，国内不少学者对百合鳞茎青霉病进行了研究。Chauhan等[4]用风信子种球作为试材研究发现，在9 ℃条件下存储，青霉病在空气相对湿度80%时比50%发病更严重。

王彩霞等[5]研究发现当浓度50 mg/L、40 ℃时醚菌酯能有效地控制青霉病，但高浓度的醚菌酯会使百合鳞茎造成药害。李渐鹏等[6]研究发现碳酸钠、硼砂和壳聚糖组成的防腐剂对青霉病有很好的抑制效果。杨迎东等[7]采用多种农药试剂对青霉病进行了研究，结果发现用50%咪鲜胺进行处理能有效地抑制青霉病。

由于多年用药抑制青霉病，已导致百合鳞茎青霉病病菌对一些药剂产生了一定程度的抗药性，Bollen[8]将百合种球上分离出来的2个青霉菌品种Penicillium brevicompaetum和P.corymbiferum分别接种到含有苯菌灵等农药的培养基上，结果显示这2种青霉菌对苯菌灵、甲基托布津、噻苯咪哇等化学农药有较强的耐药性，且在普通琼脂培养基上培养90 d后，耐药性仍未减弱。为了解目前常用药剂醚菌酯、嘧菌酯、丙环唑、苯醚甲环唑对青霉病病菌的敏感状况，笔者研究了百合鳞茎青霉病菌对不同药剂的敏感性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株。

2016年从宜春市郊东门蔬菜批发市场采集百合鳞茎青霉病菌样品，在室内进行单孢分离纯化后得到单孢菌株，通过斜面（4 ℃）和滤纸片法低温（-20 ℃）保存在江西省宜春学院植物保护实验室。

1.1.2 供试药剂。

98%嘧菌酯原药由上虞颖泰精细化工有限公司生产;95% 醚菌酯原药由江苏盐城福利德化工有限公司生产;95%苯醚甲环唑原药由湖北康宝泰精细化工有限公司生产;95%丙环唑原药由常州天择化工有限公司生产;以上原药均用丙酮溶解配制成1×104  μg/mL的母液，放置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.1.3 培养基。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL ，用于百合鳞茎青霉病菌对嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲环唑、丙环唑敏感性测定。

1.1.4 供试仪器及常用器皿。

SW-CJ-1B超净工作台，由苏州尚田洁净技术有限公司生产;SYQ-DSX-280灭菌锅，由上海申安医疗器械厂生产;MJP-250培养箱，由上海森信实验仪器有限公司生产;BCD-539WT冰箱，由青岛海尔股份有限公司生产;ME204G电子天平，由梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产;镊子、挑针、打孔器、接种环、电炉、三角瓶、容器瓶、棕色广口瓶、封口膜、直尺等为实验室常用耗材。

1.2 试验方法

1.2.1 含药培养基的制备。将嘧菌酯稀释成0.01、0.1、1、5、10、100 μg/mL 6个浓度置于45 ℃ PDA培养基中，制成含药平板。分别将醚菌酯、苯醚甲环唑、丙环唑稀释成0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、100.00 μg/mL置于PDA培养基中，制成含药培养基平板。

1.2.2 敏感性测定。采用菌丝生长速率法[9]，将供试百合鳞茎青霉病菌单孢菌株在含药平板上分别进行嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲环唑、丙环唑的抗药性测定。每种药剂均设置0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、100.00 μg/mL 6个浓度，以不加药剂的平板为空白对照;在新鲜的百合鳞茎青霉病菌菌落边缘打取6 mm的菌饼，接种于含药培养基的平板中央，在23 ℃黑暗培养72 h，测量菌落直径，计算菌丝生长抑制百分率，制作抑菌率变化趋势图，并求出毒力回归方程、相关系数、有效抑制中浓度（EC50值）。

抑制率=（对照菌落生长直径-药剂处理菌落生长直径）/（对照菌落生长直径-接种菌的菌饼直径）×100%

抗性水平依据纪明山等[10]的敏感基线值进行判别，当菌株的EC50值小于0.455 μg/mL时为敏感菌株;当菌株的EC50值处于0.455～0.911 μg/mL时为低抗菌株;当菌株的EC50值处于0.911～3.644 μg/mL时为中抗菌株;当菌株的EC50值大于3.644 μg/mL时为高抗菌株。

2 结果与分析

2.1 不同试剂对百合鳞茎青霉病菌的抑菌率及抑菌趋势 由图1可知，醚菌酯和丙环唑对百合鳞茎青霉病菌的抑菌率相对较高，在低浓度0.01 μg/mL时二者抑菌率均在50%以上;5.00 μg/mL时二者抑菌率均在80%以上;二者抑制效果接近。相比之下，苯醚甲环唑和嘧菌酯对百合鳞茎青霉病菌的抑菌率相对较低，但当浓度大于5.00 μg/mL时苯醚甲环唑抑菌率明显升高。嘧菌酯对百合鳞茎青霉病菌的抑菌率在5.00 μg/mL时一直较低，仅高浓度100.00 μg/mL时抑菌率较高。

2.2 不同试剂、不同浓度间抑菌差异性分析

根据嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲环唑、丙环唑对百合鳞茎青霉病菌的抑菌率，方差分析结果表明，浓度间F值为16.13，在0.05水平上的显著值是2.90，F=16.13>F0.05（5，15）=2.90，浓度间差异显著，即6种不同浓度0.01、0.10、1.00、5.00、10.00、100.00 μg/mL对百合鳞茎青霉病菌的抑菌率差异显著。

不同试剂间F值为11.09，在0.01水平上的显著值是5.42，因此F=11.09>F0.01（3，15）= 5.42，不同种试剂间差异极显著，即嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲環唑、丙环唑4种不同试剂对百合鳞茎青霉病菌的抑菌率差异极显著。

用LSD法做相互比较，经计算得出LSD0.05=17.11%，LSD0.01=23.66%。

从表1可以看出，相邻两浓度间抑菌率无显著差异，不相邻两浓度间抑菌率存在显著差异，如在浓度1.00与10.00 μg/mL间和100.00与5.00 μg/mL间抑菌率存在显著差异，浓度间相隔越大抑菌率显著性差异也越大。

用LSD法做相互比较，经计算得出LSD0.05=13.98%， LSD0.01=19.33%。从表2可以看出，丙环唑与醚菌酯，苯醚甲环唑与嘧菌酯间抑菌率无显著差异，丙环唑、醚菌酯分别与苯醚甲环唑间抑菌率存在显著差异，丙环唑、醚菌酯分别与嘧菌酯间抑菌率存在极显著差异，且丙环唑和嘧菌酯的抑菌率显著性更大。