铁线莲属植物ISSR-PCR 反应体系优化及遗传多样性分析

余伟军， 姚 红， 孙瑞琦， 王桂青， 钟淮钦， 黄敏玲，①， 曾黎辉，①

(1. 福建农林大学园艺学院， 福建 福州 350002； 2. 福建省农业科学院作物研究所， 福建 福州 350013)

铁线莲(ClematisfloridaThunb.)中观花品种的观赏性好、抗逆性强，是园林应用中不可多得的藤本花卉。 铁线莲在日本以及欧洲许多国家的各类花园和家庭园艺中均有应用[1]，深受人们喜爱。 铁线莲属(ClematisLinn.)中部分种类具有清热利尿和止痛祛风等功效[2]，药用价值和经济价值很高。 目前，越来越多的研究人员致力于铁线莲属植物的开发与利用，以获得更大的市场效益。

全世界铁线莲属植物有350 多种[3]，除南极洲外，在全世界范围内广泛分布。 国内该属植物超过140 种，在全国各地均有分布，其中，在华中和西南地区的分布面积较大，并且，该属植物在云南分布的种类最多，约有60 种以及20 变种[4]。

《中国植物志》[5]89-235将铁线莲属植物划分为8 组：尾叶铁线莲组〔Sect.Viorna(Reichb.) Prantl〕、长瓣铁线莲组〔Sect.Atragene(Linn.) DC.〕、黄花铁线莲组〔Sect.Meclatis(Spach) Tamura〕、灌木铁线莲组(Sect.FruticellaTamura)、威灵仙组(Sect.ClematisTamurin)、铁线莲组(Sect.ViticellaDC.)、绣球藤组(Sect.CheiropsisDC.) 和丝铁线莲组( Sect.NaraveliopsisHand.-Mazz.)。 已有研究者对铁线莲属植物的组织构造、细胞学和形态特征等方面[6-10]进行研究，为该属植物的鉴定和分类奠定了基础。 由于铁线莲属植物分布广泛，种类繁多，遗传背景复杂多样，仅通过花萼性状和雄蕊被毛等生物学特征不能准确地鉴定和分类，因此，应在形态学研究的基础上结合分子生物学方法，对该属植物进行更全面的研究。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记使用的引物无需了解DNA 序列，且较RFLP、RAPD 和SSR 具有更高的多态性和遗传稳定性[11-12]。 本研究利用ISSR 技术建立铁线莲ISSR-PCR 最佳反应体系，对收集的国内外32 个铁线莲属植物(包括8 个野生种、1 个变种和23 个品种)以及2 个近缘属植物〔包括铁筷子品种‘水晶’ (Helleborusthibetanus‘Winterbells’) 和 耧 斗 菜 品 种 ‘ 喜 鹊 ’ (Aquilegia viridiflora‘Magpie’)〕进行亲缘关系和遗传多样性分析，以期为铁线莲属植物中种、变种和品种的分类提供科学依据，并为铁线莲属植物种质资源的利用和新品种选育提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试34 份材料中，包括短柱铁线莲(Clematis cadmiaBuch.-Ham. ex Wall.)、 吴 兴 铁 线 莲(C.huchouensisTamura)、 灰 叶 铁 线 莲 〔C.canescens(Turcz.) W. T. Wang et M. C. Chang〕、贵州铁线莲(C.kweichowensisC. Pei)、毛蕊铁线莲(C.lasiandraMaxim.)、棉团铁线莲(C.hexapetalaPall.)、曲柄铁线莲(C.repensFinet et Gagnep.)和厚叶铁线莲(C.

crassifoliaBenth.)8 个野生种，分别采自浙江省湖州市长兴县、浙江省湖州市吴兴区、四川省阿坝藏族羌族自治州马尔康县、湖北省十堰市竹溪县、湖南省怀化市沅陵县、北京市怀柔区喇叭沟门满族乡、四川省乐山市峨眉山和广东省从化市吕田镇；还包括大花小木通〔C.armandiivar.farquhariana(Rehder et E.H. Wilson) W. T. Wang〕 1 个 变 种， ‘ 灵 感 ’(‘Inspiration’)、‘如古’(‘Rooguchi’)、‘包查德伯爵夫人’ (‘Comtesse de Bouchaud’)、 ‘ 魔 法 喷 泉’(‘Magic Fountain’)、‘翠鸟’(‘Kingfisher’)、‘钻石’(‘Diamantina’)、‘红星’ (‘Red Star’)、‘皇帝’(‘Kaiser’)、‘杰出’(‘Superba’)、‘斯托尔韦克’(‘Stolwijk Gold’)、‘柠檬之梦’(‘Lemon Dream’)、‘阿迪森’(‘Addisonii’)、‘帕斯卡’(‘Pascal’)、‘樱桃 唇 ’ (‘ Cherry Lip ’)、 ‘ 苹 果 花 ’ (‘ Apple Blossom’)、 ‘ 倒 影’ (‘Reflections’)、 ‘ 乌 托 邦’(‘Utopia’)、‘绿玉’(‘Alba Plena’)、‘铃儿响叮当’(‘Jingle Bells’)、‘雀斑’(‘Freckles’)、‘波兰精神’(‘Polish Spirit’)、‘前卫’(‘Avant Garde’)和‘开心果’(‘Pistachio’)23 个铁线莲属品种以及铁筷子品种‘水晶’和耧斗菜品种‘喜鹊’2 个近缘属植物，均购自浙江虹越花卉股份有限公司。

ISSR 分子标记使用的86 条通用引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。 10×ExTaqBuffer2+(MgPlus)、dNTPs 和TaKaRaExTaq酶购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 的提取 采用CTAB 法[13]提取基因组DNA，采用质量体积分数1.0%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA，并用UV-9000S 紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)测定基因组DNA 的浓度和质量，于-18 ℃保存、备用。

1.2.2 ISSR-PCR 反应体系的优化 在25.0 μL ISSR-PCR 反应体系中，包括TaKaRaExTaq酶0.2μL，10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus) 2.0 μL，模板DNA浓度分别为10、20、40、60、80 和100 ng·μL-1，引物浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 μmol·L-1，dNTPs 浓度分别为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 和0.35 mmol·L-1。 在进行其中某一因子或水平实验时，其他因子固定为模板DNA 浓度 40 ng·μL-1、引 物 浓 度0.4 μmol · L-1及dNTPs 浓 度0.20mmol·L-1。 扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，50 ℃退火l min，72 ℃延伸1 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。 PCR 产物于4 ℃保存。扩增反应参数的优化均使用引物879。

1.2.3 ISSR 引物的筛选及退火温度的确定 利用优化的ISSR-PCR 反应体系，以灰叶铁线莲和‘樱桃唇’基因组DNA 为模板，对86 条ISSR 引物进行筛选，选出扩增结果重复性好、扩增条带清晰且多态性高的引物。

设置45.7 ℃、47.7 ℃、50.4 ℃、51.8 ℃、54.0 ℃和55.4 ℃ 6 个退火温度，确定所筛选引物的最佳退火温度。

1.2.4 ISSR 扩增 利用筛选出来的引物、最佳退火温度以及优化的ISSR-PCR 反应体系对供试34 份材料的基因组DNA 进行扩增。 扩增产物在0.5×TAE电泳缓冲液中用质量体积分数1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，EB 染色10 min，JS-2000 凝胶成像分析系统(上海培清科技有限公司)扫描并保存电泳图。

1.3 数据整理和统计

统计ISSR-PCR 扩增产物同一位置的条带，有条带记为“1”，无条带记为“0”，利用EXCEL 2003 软件进行数据统计。 利用SPSS 13.0 统计分析软件计算各材料间的遗传距离。

2 结果和分析

2.1 DNA 提取及检测

部分铁线莲属植物基因组DNA 的电泳检测结果见图1。 结果显示：扩增条带明亮清晰。 各样品的OD260/OD280比值在1.6 ～2.0 之间，说明蛋白质和多酚类等干扰物质含量少。

图1 铁线莲属部分植物基因组DNA 的电泳检测结果Fig. 1 Electrophoresis detection result of genomic DNA from some of Clematis Linn. plants

2.2 ISSR-PCR 反应体系优化

铁线莲属植物基因组DNA 的ISSR-PCR 反应体系优化结果见图2。 结果显示：当模板DNA 浓度为40 ng·μL-1、引物浓度为0.4 μmol·L-1和dNTPs 浓度为0.15 mmol·L-1时，扩增条带较多且清晰度最好。 最终确定ISSR-PCR 最佳反应体系的总体积为25.0 μL，包括40 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL、0.4μmol·L-1引物1.0 μL、0.15 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL、10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus) 2.0 μL、TaKaRaExTaq酶0.2 μL 和ddH2O 18.8 μL。

图2 铁线莲属植物基因组DNA 的ISSR-PCR 反应体系优化结果Fig. 2 Optimization result of ISSR-PCR reaction system of genomic DNA from Clematis Linn. plants

2.3 ISSR 引物的筛选和扩增结果

分别用灰叶铁线莲和‘樱桃唇’的基因组DNA为模板，对86 条ISSR 引物进行筛选，选出扩增条带多且清晰的引物13 条。 对筛选出的13 条引物分别设置6 个退火温度进行PCR 扩增，确定各引物的最佳退火温度(表1)。

表1 用于32 个铁线莲属植物及2 个近缘属植物基因组DNA ISSR-PCR 反应的引物和退火温度及扩增结果Table 1 Primers and annealing temperature used for ISSR-PCR reaction of genomic DNA from 32 plants of Clematis Linn. and 2 plants of related genera and their amplification results

利用筛选出的13 条引物对32 个铁线莲属植物及2 个近缘属植物基因组DNA 进行ISSR-PCR 反应，扩增结果(表1)显示：13 条引物共扩增出172 个条带(位点)，平均每条引物扩增出13.2 个位点，其中，多态性位点168 个，平均每条引物扩增出12.9 个多态性位点，平均多态性位点百分率为98.2%。 13条引物中，引物845 和892 扩增出的位点数最多，均为18 个。 其中，引物886 对32 个铁线莲属植物及2 个近缘属植物基因组DNA 的ISSR-PCR 扩增图谱见图3。

图3 引物866 对32 个铁线莲属植物及2 个近缘属植物基因组DNA 的ISSR-PCR 扩增图谱Fig. 3 ISSR-PCR amplification pattern of genomic DNA from 32 plants of Clematis Linn. and 2 plants of related genera using primer 886

2.4 遗传多样性分析

基于ISSR-PCR 扩增结果的32 个铁线莲属植物及2 个近缘属植物的聚类图见图4。

由图4 可以看出：32 个铁线莲属植物及2 个近缘属植物的遗传距离在0.22～1.21 之间，其中，32 个铁线莲属植物的遗传距离在0.22 ～1.09 之间，铁筷子品种‘水晶’和耧斗菜品种‘喜鹊’与32 个铁线莲属植物的遗传距离较远。 在遗传距离1.02 处，将32 个铁线莲属植物分为3 个大组，‘杰出’单独聚为1 个大组，‘斯托尔韦克’和‘柠檬之梦’聚为1 个大组，其余29 个铁线莲属植物聚为第3 大组；在遗传距离0.92 处，将第3 大组进一步划分为3 个亚组，第1 亚组包括‘阿迪森’、‘帕斯卡’和‘樱桃唇’，第2 亚组包括短柱铁线莲、灰叶铁线莲、毛蕊铁线莲、曲柄铁线莲、‘铃儿响叮当’和‘雀斑’，第3 亚组包括吴兴铁线莲等20 个铁线莲属植物；在遗传距离0.77 处，将第3 亚组又进一步划分为7 个小组，其中，吴兴铁线莲和贵州铁线莲聚为1 个小组。

供试32 个铁线莲属植物中，8 个野生种(短柱铁线莲、毛蕊铁线莲、灰叶铁线莲、曲柄铁线莲、吴兴铁线莲、贵州铁线莲、棉团铁线莲和厚叶铁线莲)、1 个变种(大花小木通)与23 个品种间亲缘关系的分析结果显示：短柱铁线莲、毛蕊铁线莲、灰叶铁线莲和曲柄铁线莲与‘铃儿响叮当’和‘雀斑’的亲缘关系较近；吴兴铁线莲、贵州铁线莲、棉团铁线莲和大花小木通与‘苹果花’的亲缘关系较近；厚叶铁线莲与‘灵感’、‘如古’和‘包查德伯爵夫人’等品种的亲缘关系较近。

图4 基于ISSR-PCR 扩增结果的32 个铁线莲属植物及2 个近缘属植物的聚类图Fig. 4 Dendrogram of 32 plants of Clematis Linn. and 2 plants of related genera based on ISSR-PCR amplification result

3 讨 论

本研究建立的铁线莲属植物基因组DNA ISSRPCR 最佳反应体系的总体积为25.0 μL，包括40 ng·μL-1模板DNA 1.0 μL、0.4 μmol·L-1引物1.0μL、0.15 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL、10×ExTaqBuffer2+(MgPlus)2.0μL、TaKaRaExTaq酶0.2μL 和 ddH2O18.8μL。 筛选出的13 条引物对32 个铁线莲属植物及2 个近缘属植物基因组DNA 的ISSR-PCR反应结果显示：共扩增出172 个条带(位点)，其中，多态性位点168 个，平均多态性位点百分率为98.2%，说明ISSR 分子标记可以应用于铁线莲不同品种以及野生种间的鉴别，也为进一步的杂交育种工作中亲本选择与杂交组合的制定提供依据。

《铁线莲栽培12 月计划》[14]将铁线莲品种划分为常绿组(包括常绿大洋组、常绿木通组和常绿卷须组)、华丽杂交组、葡叶组、大叶组、西藏组、蒙大拿组、全缘组、德克萨斯组、尾叶组、长瓣组、早花大花组、晚花大花组、南欧组和佛罗里达组。 本研究对32个铁线莲属植物的聚类结果与铁线莲的园艺分类结果较为一致，如第1 等级划分出蒙大拿组(‘杰出’)和长瓣组(‘金叶子’和‘柠檬之梦’)与其他组间的差异；第2 等级划分出德克萨斯组(‘阿迪森’、‘帕斯卡’和‘樱桃唇’)与其他组之间的差异；第3 等级划分出常绿组(‘苹果花’)、全缘组(‘灵感’和‘如古’)和大花组(‘包查德伯爵夫人’、‘魔法喷泉’、‘翠鸟’、‘钻石’、‘红星’和‘皇帝’)与其他组间的差异，由此可见，ISSR 分子标记不仅能够区分铁线莲不同品种的分组，对于同一分组中亲缘关系较近的类群也能检测出较高的多态性[15]。

本研究首次从分子水平鉴定了铁线莲属野生种与品种间的亲缘关系，结果显示：短柱铁线莲、毛蕊铁线莲、灰叶铁线莲和曲柄铁线莲与常绿卷须组的亲缘关系较近；吴兴铁线莲、贵州铁线莲和棉团铁线莲与常绿木通组的亲缘关系较近；厚叶铁线莲与全缘组和早花大花组的亲缘关系较近。 相关研究结果表明：短柱铁线莲和吴兴铁线莲属于铁线莲组[16]，毛蕊铁线莲、曲柄铁线莲和贵州铁线莲属于尾叶铁线莲组[17]，灰叶铁线莲属于灌木铁线莲组[18]，棉团铁线莲属于威灵仙组棉团铁线莲亚组(Subsect.AngustifoliaTamura)[5]153-156，[19]，而本文的研究结果显示短柱铁线莲和毛蕊铁线莲的亲缘关系更近，吴兴铁线莲和贵州铁线莲的亲缘关系更近。 推测导致这一结果的原因可能是由于生物学性状容易受到环境等外界因子的影响，说明传统的生物学形态分类方法不能完全准确鉴定铁线莲属植物的亲缘关系，建议结合分子标记等生物学方法与形态学性状进行进一步验证。

本研究结果还显示：‘魔法喷泉’与‘钻石’并非市场上所说的同物异名，而是2 个不同的园艺品种。此外，2 个近缘属植物铁筷子品种‘水晶’和耧斗菜品种‘喜鹊’与 ‘杰出’的遗传距离较近，建议进行授粉杂交，观察这2 个品种是否能够通过与铁线莲属植物进行属间远缘杂交来改造铁线莲属植物的基因组，获得更多的优良性状。