氯化锂对APP/PS1双转基因小鼠脑组织中β淀粉样蛋白含量的影响*

向洁， 曾晓晓， 曹坤， 董阳婷， 徐毅， 冉龙艳， 邓婕， 官志忠,**

(1．贵州医科大学附院 病理科， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学 贵州省医学分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004)

阿尔兹海默病(alzheimer’s disease,AD)，又称老年性痴呆，在全球的发病率日益增加，但由于AD复杂的发病因素与分子机制，到目前为止，所有治疗AD的药物仅能在一定程度上改善患者症状，但不能改变患者的发病进程[1-2]。AD的主要神经病理学特征为β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)形成的老年斑及tau蛋白磷酸化导致的神经元纤维缠结[3-4]，Aβ来源于β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)，由β及γ分泌酶进行分解而来[5]。当Aβ的产生和降解处于失衡状态时，过量的Aβ在人脑中堆积[6]，而Aβ的异常沉积对神经元的毒性作用在AD发病中具有重要影响[7-8]。锂被发现用于临床研究及治疗已超过60年，特别是在治疗躁狂发作、双相障碍等精神疾病中被广泛应用、且效果良好[9-10]。近年来，针对锂治疗作用的研究越来越多，特别在神经疾病方向研究中也有了新的突破。现在已经肯定锂作为糖原合成激酶-3β(glycogen synthetic kinase-3β，GSK3β)的经典抑制剂，对GSK3β活性的调节具有重要作用[11]，对蛋白磷酸化导致的神经纤维缠结有显著的减轻作用[12-13]。尽管锂在AD等神经退行性疾病防治中的潜在用途被众人关注，但其对神经系统的保护作用机制研究报道较少。本研究以APP/突变型人早老素1(PS1)双转基因小鼠作为类AD动物模型，以野生型小鼠作为对照，采用氯化锂(lithium chloride，LiCl)灌胃小鼠2个月，观察LiCl是否能降低小鼠脑组织中的Aβ含量，观察小鼠脑组织中老年斑含量，分析LiCl是否能减少Aβ对神经系统的毒性作用，发挥神经保护作用，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

实验动物为上海南方模式生物科技发展有限公司提供的20只，C57BL/6J雌性野生型小鼠5只，B6.Cg-Tg(APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax种鼠，体质量均为20～30 g，生产许可证编号为SCXK(沪)2014-0002。主要试剂：LiCl(美国 Sigma公司)，小鼠Aβ42ELISA 试剂盒(美国 Invitrogen公司)，ABC免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒、SG显色试剂盒、中性树胶封片剂(美国 Vectorlabs公司)，2×PCRTagMix(日本 TaKaRa公司)，DL2000DNA Marker(北京天根生物公司)， Anti-Aβ6E10(美国 Govance公司)。

1.2 方法

1.2.1AD动物模型的制备 5只4月龄B6.Cg-Tg(APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax种鼠与20只雌性野生型C57BL/6J小鼠(20～30 g)在SPF级的动物房中以30%～50%湿度、22～25 ℃温度条件下适应喂养1周，以1∶4的比例将种鼠与雌鼠合笼交配，仔鼠出生第10天时进行鉴定，分选出野生型及APP/PS1双转基因小鼠；喂养至1月龄时，进行雌雄分笼，饲养于光照与黑暗各12 h的恒温独立通风笼内，每笼5只，自由摄食及饮水。将小鼠分为4组(每组6只)，分别为野生型 (wild type，WT组) 组、WT+Li组、APP/PS1组及APP/PS1+Li组，各组小鼠均自由摄食及饮水，WT组及APP/PS1组小鼠在4月或8月龄时，对其进行生理盐水灌胃处理，1次/d，为期2个月；WT+LiCl组及APP/PS1+LiCl组小鼠在4月或8月龄时，用LiCl(100 mg/kg)灌胃处理，1次/d，为期2个月[14]。

1.2.2小鼠DNA提取 剪取1周龄以上小鼠0.2～0.4 cm尾端，将鼠尾放入已编号的1.5 mLEppendorf(Epp)管中；每管加入裂解液0.5 mL及蛋白酶K贮存液0.05 mL，混匀后放入56 ℃水浴箱中过夜；以12 000 r/min离心10 min，取上清入新的1.5 mL Epp管中，加入无水乙醇1 mL，12 000 r/min离心10 min，弃上清，加70%乙醇1 mL，12 000 r/min离心10 min，弃上清，倒扣风干15 min，加ddH2O 200 μL轻轻吹打使之完全溶解；在室温中放置到DNA完全溶解后定量，直接进行PCR处理。

1.2.3APP及PS1基因检测 采用PCR法，按照表1所示APP及PS1基因的引物序列合成相应引物；取出已制备好的小鼠模板DNA，按照ddH2O 8.5 μL、2×PremixTag 12.5 μL、APP上游0.5 μL、APP下游0.5 μL、PS1上游0.5 μL PS1下游0.5 μL、GenomicDNA 2 μL配制总反应体系(共25 μL)，进行PCR扩增，扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30个循坏，72 ℃最后延伸5 min。同时制备1.5%琼脂糖凝胶，待PCR产物扩增完成后，进行凝胶电泳，于凝胶成像分析系统Gene Sys进行曝光分析。

表1 APP及PS1引物序列Tab.1 Primer sequences used for genotyping mouse APP and PS1 genes

1.2.4小鼠脑组织中老年斑含量 采用免疫组织化学法检测，取小鼠右侧大脑半球正矢状面脑组织，4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、石蜡包埋、切片(4 μm)。老年斑检测：常规脱蜡(二甲苯10 min×3次)、酒精水化(100%、95%、75%、50%、双蒸水，各10 min)，柠檬酸盐修复(pH 6.0，高压锅修复2.5 min)，3%双氧水去除内源性过氧化物酶(10 min)，1×PBST洗涤切片(5 min×3次)，10%马血清封闭1 h，一抗孵育4 ℃过夜(Anti-Aβ6E10 1∶50)，l×PBST洗涤(5 min×3次)，按照ABC免疫组化试剂盒说明书进行二抗孵育(1∶50)，l×PBST洗涤(5 min×3次)，显微镜下DAB显色(阳性为棕色)，蒸馏水终止显色，酒精上行脱水(75%、95%、100%，各10 min)、二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。

1.2.5小鼠脑组织中不可溶性Aβ含量测定 按照小鼠Aβ42ELISA 试剂盒说明书配置所需试剂。取0.1 g脑组织，用配置好的裂解液进行组织匀浆，制备样品。确定8连管数量，向空白孔中加入标准品稀释液100 μL，作为空白对照；向孔中加入标准品、样品或对照样品100 μL，混合均匀，室温孵2 h，吸出液体，清洗液洗4次；每孔加入Aβ42检测抗体100 μL，除空白对照孔外，液体为蓝色，轻轻敲打板侧面进行混合；室温孵育1 h，吸出液体，清洗液洗4次；加入抗兔IgG-HRP工作液(二抗)100 μL，空白对照孔不加；室温孵育30 min,吸出液体，清洗液洗4次；每孔加入稳定着色剂100 μL，液体开始变蓝，每孔中加入StopSolution液100 μL，轻轻敲打板侧面，24 h内读板；绘制标准曲线，从标准曲线中读取未知样品和对照Aβ42浓度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 APP/PS1双转基因小鼠基因鉴定

如图1所示，以新生小鼠DNA为模板扩增，可见在 9只小鼠中有 3 只小鼠(1、4、7)基因组 DNA 扩增出400 bp及600 bp大小的目的片段，与所设计的APP及PS1基因扩增片段大小一致。证实该小鼠为APP/PS1双转基因小鼠。

注：M 为DL2000DNAMarker，1、4、7号是APP/PS1双转基因阳性小鼠，其余为野生型小鼠图1 APP/PS1双转基因小鼠基因鉴定Fig.1 The genotype pattern of the APP gene and PS1 gene in APP/PS1 double transgenic mice

2.2 小鼠脑组织老年斑数量

如图2所示，与WT组小鼠相比， APP/PS1组小鼠脑组织有不同程度的老年斑生成，两组数量比较，差异有统计学意义(P<0.05)，10月龄小鼠更明显；而对APP/PS1双转基因小鼠给予LiCl灌胃处理后，其脑组织内老年斑数量较未经LiCl处理的同龄APP/PS1小鼠显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05)；WT+Li组小鼠与WT组小鼠比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

(1)与WT组比较，P<0.05；(2)与APP/PS1组比较，P<0.05图2 6月龄和10月龄小鼠脑组织中老年斑数量(DAB染色)Fig.2 Senile plaques in the brains of Wt mice and APP/PS1 mice at 6 and 10 months old

2.3 小鼠脑组织内不可溶性 Aβ含量

由图3所示，与WT组小鼠比较， APP/PS1组小鼠脑组织内不可溶性Aβ含量显著增加(P<0.05)，10月龄小鼠更明显；而对APP/PS1双转基因小鼠给予LiCl灌胃处理后，其脑组织内不可溶性Aβ含量较未经LiCl处理的同龄APP/PS1小鼠显著减少(P<0.05)；WT+Li组小鼠与WT组小鼠比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

(1)与WT组比较，P<0.05；(2)与APP/PS1组比较，P<0.05图3 6月龄及10月龄小鼠脑组织内不可溶性Aβ含量(ELISA)Fig.3 The content of Aβ42 of 6 and 10 months-old mouse brains

3 讨论

到目前为止，有关AD发病机制方面报道得最多是淀粉样肽瀑布假说，该学说主要指出了脑内Aβ产生和清除的不平衡导致了Aβ增多，结果引起脑组织神经元退行性变而发生AD[15-16]。Aβ可通过干扰钙稳态使线粒体功能障碍，诱导皮质和海马神经元变性，并可直接损伤突触可塑性及记忆功能[17]，在 AD 发病机制中起着核心作用[18]。APP/PS1双转基因小鼠表达嵌合小鼠/人淀粉样前体蛋白(Mo/HuAPP695swe)和PS1，中枢神经系统神经元内这2种突变都与早发性AD有关。研究发现，5月龄的APP/PS1双转基因小鼠脑组织内即可出现明显的淀粉样斑块，且年龄越大的双转基因小鼠其脑中β淀粉样蛋白含量及老年斑沉积越多[19]。本实验选用4月龄小鼠开始灌胃处理，探究LiCl是否能够预防双转基因小鼠脑组织中β淀粉样蛋白的过多生成。另外，对8月龄双转基因小鼠灌胃处理2个月，研究LiCl在β淀粉样蛋白产生过多、老年斑生成后，能否减少其含量，逆转痴呆模型鼠的病理学改变。

锂作为一种情绪稳定剂，自被发现以来一直被用于治疗精神疾病，对其改善神经系统功能，对AD的潜在治疗作用等方面已经进行了研究[20]。有报道指出，锂作为GSK-3β有效抑制剂，通过调控GSK-3β下游多条信号通路，发挥其抗氧化、抗炎和维持蛋白质稳态的特性[21]。同时LiCl对突触萎缩可以有良好的治疗作用，能逆转冈田酸造成的突触损害[22]。Cisternas等[23]指出，锂通过调节Wnt/β-catenin信号通路改善AD患者糖代谢紊乱，从而发挥改善学习记忆功能的有益作用。锂作为一种多方向治疗药物，在对抗复杂的痴呆分子病理学方面具有优势。在本研究结果显示，与WT型小鼠相比，6月龄及10月龄APP/PS1双转基因小鼠脑组织中有较多数量的老年斑，不可溶性Aβ含量显著增加。与此同时，本研究还分别对4月及8月龄的APP/PS1双转基因小鼠给予LiCl灌胃处理2个月，结果发现这些APP/PS1双转基因小鼠脑组织中老年斑数量及不可溶性Aβ含量与未经LiCl处理的同龄APP/PS1小鼠比较显著降低，差异有统计学意义，提示LiCl能预防及逆转APP/PS1双转基因小鼠脑组织中Aβ含量的增多及老年斑的生成，可能降低Aβ在AD发病过程中的毒性作用。Pan等[24]最新研究也发现LiCl处理使APP/PS1双转基因小鼠脑微血管LRP1蛋白表达增加及并促进脑脊液循环整体流通，从而能促进脑组织中可溶性Aβ的清除。

综上所述，LiCl处理可减少APP/PS1双转基因小鼠脑组织Aβ含量，可能是通过预防其产生或者加速其清除完成的，对AD的药物治疗有一定的参考意义。