汉黄芩素对LPS和ATP联合诱导的巨噬细胞炎症反应的抑制作用①

张海丽 游雷鸣 刘 慧 刘欢苇 周思瑶 吴 珺 郝 钰

(北京中医药大学生命科学学院免疫与微生物学系，北京100029)

黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科植物黄芩的干燥根，始载于《神农本草经》，从秦汉时期开始，黄芩就已经被应用于临床，到现在已经有两千多年的历史。历代的中医药文献均有对黄芩的记载，黄芩的临床配伍应用广泛，临床疗效显著。汉黄芩素(5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮)源自黄芩根提取物，为黄芩中主要的活性物质，是一种天然存在的黄酮类化合物，该类化合物在结构上的特异性，主要在于它们在黄酮B环上不含有4位羟基，而A环上具有大多数黄酮不具有的6位羟基(黄芩素)或8位甲氧基(汉黄芩素)。因其只在黄芩根部合成，故将其称为根特异性黄酮。相关研究已经证实，汉黄芩素可抑制肾脏炎症，如减少巨噬细胞浸润，减少炎性细胞因子产生和抑制受损肾脏中NF-κB活化。现代药理学研究表明，汉黄芩素具有抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡、抗血管生成和促进肿瘤细胞分化的作用[1-4]。

巨噬细胞(Macrophage,Mφ)是机体固有免疫系统的重要免疫细胞之一，在病原微生物的清除，促进炎症反应，诱发适应性免疫应答以及组织损伤后的修复与重构过程中起关键作用[5]。内源性或外源性的多种刺激可引起巨噬细胞活化，特别是细胞中NLRP3炎性体的活化[6]，进而产生大量的促炎因子(如IL-1β、IL-18、IL-6以及TNF-α)和杀菌物质，这些杀菌物质包括基质金属蛋白酶12(Matrix metalloproteinase 12,MMP12)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，其中ROS是O2带电子后的产物，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮等[7]。同时，巨噬细胞分泌的趋化因子，如CCL2 (MCP1)和IL-8 (CXCL8)，还可以募集趋化大量的中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞向炎症部位迁移，以加重炎症反应[8]。虽然汉黄芩素有良好的抗炎作用，但其对巨噬细胞炎症反应的干预作用，特别是其抑制巨噬细胞炎症反应的作用机制还知之甚少。因此，本研究以脂多糖(LPS，一种病原相关分子模式)和三磷酸腺苷(ATP)(一种损伤相关分子模式)联合刺激小鼠巨噬细胞为炎症模型，探究汉黄芩素对巨噬细胞炎症反应的抑制作用。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠巨噬细胞系RAW264.7(ATCC:TIB-71)，由北京中医药大学免疫与微生物学系实验室保存。汉黄芩素中药单体购自中国药品生物制品检定所，反转录试剂盒、ATP购自TaKaRa公司，RNA提取试剂TRIZOL购自Invitrogen公司，SYBGreen 荧光定量PCR试剂盒购自ToYoBo公司，LPS购自Sigma公司，兔抗小鼠NF-κB(P65亚基)抗体购自CST公司，山羊抗兔IgG抗体、小鼠TNF-α检测 ELISA试剂盒及小鼠IL-6 检测ELISA试剂盒均购自abcam公司，ROS检测试剂盒购自凯基生物公司，胎牛血清购自HyClone公司，引物采用Primer 5.0设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将RAW264.7细胞接种在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2无菌培养箱中培养。

1.2.2汉黄芩素对巨噬细胞RAW264.7的最大无毒浓度测定 将处于对数期生长期的细胞用细胞刮刀刮下，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤离心后，用细胞培养液重悬调整细胞浓度至5×104个细胞/ml并加入96 孔板中(100 μl/孔)。活力测定实验分为调零组(培养基)、对照组以及不同终浓度(28、56、70、84、98、112、140、168 μmol/L)汉黄芩素作用组，每组设6个复孔。细胞培养箱中培养24 h后，每孔加入MTT(终浓度0.5 mg/ml)继续培养4 h后弃掉孔内上清，各孔加100 μl的DMSO，振荡摇匀10 min以充分裂解细胞，使用全波长酶标仪检测OD值(波长570 nm)，分析不同浓度汉黄芩素对细胞活力(增殖)的影响，细胞增殖抑制率为10%时的药物终浓度为汉黄芩素对巨噬细胞RAW264.7的最大无毒浓度，即本研究所用汉黄芩素的最大终浓度。细胞存活率(%)=(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100%。

1.2.3汉黄芩素对LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的影响 将RAW264.7细胞接种到24孔板中，约5×105个细胞/孔，设对照组(正常培养不做刺激)，LPS和ATP联合刺激组(LPS刺激4 h后加ATP继续刺激30 min)，汉黄芩素干预组(LPS刺激4 h后加ATP继续刺激30 min，刺激的同时加入汉黄芩素)，每组3个复孔。收集细胞上清液，参照ELISA试剂盒说明书分别测定各孔细胞上清液中炎性因子TNF-α、IL-1β的水平。实验过程中LPS的终浓度为1 μg/ml，ATP的终浓度为5 mmol/L，汉黄芩素的终浓度为1 4、28、56 μmol/L(该浓度为1.2.2中测得的无毒浓度)。

表1 设计并合成的引物

Tab.1 Primers designed and synthesized in this study

PrimersSequence (5′to 3′)qR_IL-1β-FACAAGAGCTTCAGGCAGGCAGTATCqR_IL-1β-RTATGGGTCCGACAGCACGAGGCqR_IL-18-FCCTGGAATCAGACAACTTTGGCCGACTqR_IL-18-RCACTTTGATCAATATCAGTCATATCCTqR_IL-6-FTGCCTTCTTGGGACTGATqR_IL-6-RTTGCCATTGCACAACTCTTTqR_TNF-α-FCCTGCTGACGGGTTTACCTqR_TNF-α-RATGGCAGACAGGATGTTGACCqR_NLRP3-FATCTTTGCTGCGATCAACAGGCGqR_NLRP3-RCGCGTTCCTGTCCTTGATAGAGTqR_Caspase-1-FTGGAAGGTAGGCAAGACTqR_Caspase-1-RATAGTGGGCATCTGGGTCqR_GAPDH-FGGTGAAGGTCGGTGTGAACGqR_GAPDH-RCTCGCTCCTGGAAGATGGTG

1.2.4汉黄芩素对LPS-ATP刺激的巨噬细胞炎性相关分子mRNA水平的影响 将巨噬细胞RAW264.7接种到6孔板中(2×106个细胞/孔)，分组与方法1.2.3描述的相同，即对照组，LPS和ATP联合刺激组，汉黄芩素(56 μmol/L)干预组，每组3个复孔。实验过程中LPS和ATP及汉黄芩素的终浓度与方法1.2.3描述的相同。弃去各孔培养基后用PBS清洗各孔细胞，用TRIZOL试剂裂解细胞(500 μl/孔)，参照说明书的操作要求分离提取各孔细胞的总RNA。参照反转录试剂盒操作说明，各取1 μg(经过DNA酶消化处理的)RNA来配制反转录体系(10 μl)合成相对应的cDNA，得到的cDNA分别用无核酸酶的双蒸水做10倍稀释后备用。取1 μl 稀释后的cDNA为模板，以小鼠GAPDH基因为内参，加入相应的引物(表1)，利用实时荧光定量PCR(qPCR)法分析各组细胞样品中相应基因的mRNA水平。定量分析的基因包括IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α、NLRP3以及Caspase-1，qPCR数据采用2-ΔΔCt法进行处理和分析。

1.2.5汉黄芩素对LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞NF-κB的核定位的影响 将巨噬细胞RAW264.7接种到激光共聚焦培养皿中(2×106个细胞/皿)，分组与方法1.2.3描述的相同，即对照组，LPS和ATP联合刺激组，汉黄芩素(56 μmol/L)干预组，每组3个复孔。实验过程中LPS，ATP及汉黄芩素的使用终浓度与方法1.2.3描述的相同。弃去培养基后，用PBS清洗细胞(2次，1 min/次)，用4%多聚甲醛溶液室温固定细胞15 min后，用PBS清洗细胞(3次，1 min/次)。接着，用0.1% Triton X-100处理细胞15 min(细胞破膜穿孔)后，PBS清洗细胞(2次，1 min/次)，然后用山羊血清封闭细胞30 min，经PBS清洗细胞后(3次，1 min/次)，滴加兔抗NF-κB抗体工作液(P65亚基单抗，1∶500稀释)，4℃过夜结合，PBS清洗细胞(3次，1 min/次)，滴加羊抗兔IgG的二抗工作液(1∶500稀释)，37℃孵育30 min后，PBS清洗细胞(3次，1 min/次)，经DAPI衬染细胞核后(蓝色)，在激光共聚焦显微镜下观察NF-κB(红色)联合定位情况。

1.2.6汉黄芩素对LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞胞内ROS产生的影响 将细胞接种到6孔板中(2×106个/孔)，设对照组(正常培养不做刺激)，LPS-ATP联合刺激组(LPS刺激4 h后加ATP继续刺激 30 min)，汉黄芩素干预组(LPS刺激4 h后加ATP继续刺激30 min，刺激的同时加入不同浓度的汉黄芩素)，每组3个复孔。实验过程中所用的LPS和ATP终浓度与方法1.2.3中描述的相同。收集各组细胞，加入DCFH-DA(ROS敏感的荧光探针)工作液，37℃孵育30 min后1 000 r/min离心10 min收集细胞，经PBS洗涤细胞后(2次，1 300 r/min)，收集细胞沉淀物，用200 μl的PBS重悬细胞沉淀后用流式细胞仪检测细胞的荧光(各组细胞中的荧光细胞比例及荧光强弱代表活性氧水平的高低)。

2 结果

2.1汉黄芩素对巨噬细胞RAW264.7的最大无毒浓度 MTT实验结果显示，用不同浓度的汉黄芩素处理RAW264.7巨噬细胞24 h后，终浓度为56 μmol/L 时对巨噬细胞的增殖抑制率为10%，即汉黄芩素对巨噬细胞RAW264.7的最大无毒浓度可以定为56 μmol/L。

2.2汉黄芩素可以有效降低LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6 巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-6水平的ELISA结果显示(图1)，与空白对照组相比，LPS和ATP联合刺激组细胞的IL-6和TNF-α水平明显升高(P<0.001)。与LPS和ATP联合刺激组细胞相比，汉黄芩素干预组细胞分泌的IL-6、TNF-α明显减少(P<0.01)，且汉黄芩素的浓度越高，IL-6和TNF-α的分泌水平也越低。

2.3汉黄芩素可以降低LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞炎性相关分子mRNA水平 定量PCR结果显示(图2)，与未经刺激的对照组巨噬细胞相比，LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞中IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α mRNA水平显著升高。特别的，编码NLRP3炎性复合体关键组分NLRP3和Caspase-1的mRNA水平也显著降低。但是，在LPS和ATP联合刺激时加入汉黄芩素干预，巨噬细胞中这些促炎因子的mRNA水平的升高可以得到明显的抑制。这些结果表明，汉黄芩素能有效降低LPS-ATP刺激的巨噬细胞炎性相关因子的mRNA水平，这将会抑制巨噬细胞的炎症反应。

图1 汉黄芩素对LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞(RAW264.7)分泌IL-6和TNF-α的影响Fig.1 Effects of wogonin on secretion of IL-6 and TNF-α in LPS and ATP-challenged macrophages (RAW264.7)

图2 汉黄芩素对LPS和ATP联合刺激的RAW264.7细胞炎症相关因子mRNA水平的影响Fig.2 Effects of wogonin on mRNA level of inflammation factors in LPS and ATP-challenged macrophages (RAW264.7)Note: The detected inflammation factor mRNAs include IL-1β,IL-18,IL-6 and TNF-α.Also,the mRNAs for the key component of NLRP3-inflammasome complex were detected,including NLRP3 and Caspase-1.

图3 汉黄芩素对LPS和ATP刺激的巨噬细胞(RAW264.7)NF-κB核定位的影响Fig.3 Effect of wogonin on nuclear location of NF-κB in LPS and ATP-challenged macrophages(RAW264.7)Note: A.Nuclear translocation of NF-κB in macrophages observed under confocal fluorescence microscope.Unchallenged.RAW264.7 cells not challenged;LPS/ATP.RAW264.7 cells were challenged with LPS and ATP;LPS/ATP+wogonin.RAW264.7 cells were stimulated with LPS and ATP in the wogonin-contained medium；B.Comparison for percentage of macrophages in which the nuclear translocation of NF-κB was observed.

图4 汉黄芩素对LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞(RAW264.7)胞内活性氧(ROS)产生的影响Fig.4 Effects of wogonin on generation of ROS in LPS and ATP-challenged macrophages (RAW264.7)Note: A.Histogram analysis of FACS (fluorescence activated cell sorting) for ROS-generated cells.The region (ROS-positive cells) defines the ROS-generated cells.Control.RAW264.7 cells not challenged;LPS/ATP.RAW264.7 cells were challenged with LPS and ATP;LPS/ATP+wogonin.RAW264.7 cells were stimulated with LPS and ATP in the wogonin-contained medium；B.Comparison for percentage of ROS-positive cells.

2.4汉黄芩素可降低LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞胞内NF-κB转录因子的核定位 激光共聚焦显微镜观察转录因子NF-κB核定位，发现LPS和ATP联合刺激组巨噬细胞胞内NF-κB被激活并发生核转位(图3)，当加入汉黄芩素(56 μmol/L)干预时，细胞核观察到的NF-κB明显减少。这些结果表明，汉黄芩素的干预可以明显减少NF-κB因子的核定位，而核内NF-κB转录因子的减少将会导致NF-κB靶基因的转录水平降低，包括NF-κB调控的一些炎性相关因子的转录，这将弱化巨噬细胞的炎症反应。

2.5汉黄芩素可以降低LPS和ATP联合刺激的巨噬细胞胞内ROS产生 流式细胞术结果显示(图4)，与未刺激的对照细胞相比，LPS和ATP联合刺激组巨噬细胞中ROS含量明显升高；与LPS和ATP联合刺激组相比，不同浓度的汉黄芩素(14、28、56 μmol/L)干预组的巨噬细胞中ROS含量都明显下降。表明汉黄芩素能显著降低LPS和ATP联合刺激的RAW264.7细胞ROS产生。

3 讨论

机体或细胞在受到有害物质刺激后，其抗氧化-氧化系统失衡，这一过程会导致活性物质的过多产生和异常堆积，尤其是ROS的大量产生。胞内过量的ROS可激活或增强NF-κB等炎性信号通路导致大量炎性因子基因转录，进而增强炎症反应[9]。正常情况下，NF-κΒ二聚体由p65(RelA)或p50构成，但p65或p50形成的二聚体和IκB(NF-κΒ抑制蛋白)结合而滞留在细胞质，此时NF-κΒ信号通路处于失活状态。当细胞受到如细胞因子、LPS和ROS等物质刺激时，IκB的激酶(IKK)活化，活化的IKK使IκB的丝氨酸残基磷酸化并在泛素连接酶的作用下泛素化进而被蛋白酶体降解，NF-κΒ得以入核启动炎症相关基因(如NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α等)的转录以介导炎症反应[10]。

机体在不同生理和病理状态下，巨噬细胞表现出不同的类型，分为M1型和M2型两大类，一类是在M1型中特异高表达的基因群(M1基因群)；另一类是在M2型中特异高表达的基因群(M2 基因群)。M1基因群具有“促炎”性，M2基因群普遍具有“抗炎”的功能。这些基因的表达产物可作为分析鉴定M1、M2 型的标志分子。通常M1基因群的高表达产物为TNF-α、IL-6等炎性因子，其细胞形态为圆形；M2基因群的高表达产物为IL-10、IL-4抗炎因子，其细胞形态为纤维细胞样。LPS刺激巨噬细胞后，可激活其胞内的IKK复合物，进而活化NF-κB炎症信号通路，诱导巨噬细胞向M1型极化，从而产生多种促炎细胞因子，诱导炎症反应[11]。本研究以LPS和ATP联合刺激的RAW264.7巨噬细胞为炎症细胞模型，当巨噬细胞同时受到LPS和ATP联合刺激时，胞内NF-κΒ信号通路和NLRP3炎性体(促进IL-1β和IL-18前体蛋白的加工和成熟)同时活化，炎症因子IL-6、TNF-α分泌水平增高，激光共聚焦显微镜下观察细胞多呈圆形[12,13]。当LPS和ATP联合刺激的同时加入汉黄芩素干预，巨噬细胞胞内ROS水平明显下降，NF-κΒ的核定位减弱，相应的炎症分子的mRNA转录降低。表明汉黄芩素可抑制LPS和ATP联合诱导的巨噬细胞炎症反应。汉黄芩素似乎是通过减少胞内ROS，降低胞内的NF-κB活性，以弱化NF-κB介导的炎症基因转录进而减弱巨噬细胞的炎症反应。但什么机制让ROS减少了，是汉黄芩素直接减少ROS产生和释放，还是汉黄芩素活化了Nrf2抗氧化信号通路来降解过多的ROS，还有待进一步的实验以检测Nrf2信号通路的活化情况。本研究在一定程度上丰富了汉黄芩素抗炎作用的研究内容，也为进一步探究其抗炎作用的分子机制提供了基础。